慢性疼痛的基因治疗

慢性疼痛的基因治疗 田 玉 科 安 珂 华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室 慢性疼痛被广泛地定义为急性组织损伤修复后疼痛持续超过1 个月、疼痛持续或反复发作超过3 个月以 上或与组织损伤有关的疼痛预计持续存在或加重。其中神经性痛、炎症性痛以及癌痛均可引发慢性疼痛。剧 烈或长期的疼痛会使机体各器官系统功能发生紊乱而影响生活、学习和工作。目前慢性疼痛的治疗主要是靠 给麻醉性镇痛剂和非甾体类抗炎药等，但往往带来耐药、成瘾，并涉及许多器官、系统的其他副作用。因此 寻找一种安全有效、作用持久、经济方便、副作用小的镇痛方法已成为人们感兴趣的课题。 随着细胞分子生物学的发展和基因工程技术的日臻完善，基因治疗作为一项新的生物干预手段，已被广 泛应用于多种疾病的治疗与研究。正是基于对慢性疼痛的分子生物学机制有了更加深入的了解，人们才有可 能在基因水平上探讨其治疗，为疼痛治疗开辟了一条新的途径，目前疼痛的基因治疗途径有两种，现就此方 面的研究现状作一简要介绍。 1、间接体内疗法（Ex vivcGene Therapy） 该疗法也称作细胞移植疗法，是早期疼痛基因治疗最常用的，被认为是一种接近于生理的、有效的镇痛 方法。它是基因治疗与移植技术相结合的方法，其要点是选择合适的基因、靶细胞及最有效的基因转移方法。 1.1 机理 基于疼痛时内源性抑制信息的不足，包括5-羟色胺、去甲肾上腺素、Y -氨基丁酸（GABA）、内源性阿 片肽如B -内啡肽、脑啡肽、强啡肽以及内源性甘丙肽和神经营养因子如脑源性神经营养因子（BDNF）等。 该方法是将体外培养的某些细胞株移植入体内，这些类似于“生物微泵”的移植细胞在中枢神经系统（脊髓） 持续分泌、缓释多种抗痛蛋白分子、抗痛蛋白调控因子、酶类或信号转导因子，从而增强局部抗痛蛋白的表 达，降低疼痛敏感性，产生良好的镇痛效果，避免了全身给药带来的副作用，目前研究最多和最深入的是嗜 铬细胞移植和基因工程细胞移植。 1.2 嗜铬细胞移植 动物实验和临床研究显示, 将同种或异种嗜铬细胞移植于机体的特定部位, 可提高宿主对疼痛的耐受性, 产生镇痛效应。1986年［USagen首先将牛肾上腺髓质嗜铬细胞移植到大鼠蛛网膜下腔，通过移植细胞不断分 泌5-TH和去甲肾上腺素以及脑啡肽等镇痛物质发挥抗痛作用；1993年Winnie等⑵将此技术应用于临床，他 将人肾上腺嗜铬细胞植入顽固性疼痛病人的脊髓蛛网膜下腔, 使 70%~80% 病人的疼痛得到明显缓解, 减少 或停止使用止痛药，从此开创了细胞镇痛研究的先河。 1.3 基因工程细胞移植 由于嗜铬细胞来源有限、原代培养时间短、难以达到满意的细胞浓度和数量以及镇痛效应不稳定等问题 限制了该技术的广泛应用。因此，随着细胞分子生物学和基因工程技术的日臻完善，转基因细胞移植镇痛将 有望取代嗜铬细胞成为治疗神经性疼痛的有效方法。该技术是将本身不表达或低表达抗痛因子的细胞株通过 体外导入治疗基因，筛选可以表达外源基因的细胞，再将这些带有治疗基因的细胞株(也称作基因工程细胞 株)移植入体内，发挥镇痛作用(详见表1)。 表 1 用于疼痛治疗的细胞株 疼痛类型 动物 细胞/分泌的物质 参考文献 急性痛 大鼠 大鼠和牛肾上腺髓质 Sagen et al,1986 Sagen ,1992 神经痛 大鼠 大鼠嗜铬细胞 Hama and Sagen ,1994 急性痛 大鼠 微囊化牛嗜铬细胞 Sagen et al, 1993 炎性痛 大鼠 大鼠肾上腺髓质 Sagen et al, 1992 炎性痛 大鼠 大鼠肾上腺髓质 Siegan and Sagen , 1997 神经痛 大鼠 大鼠肾上腺髓质 Brewer and Yezierski,1998 神经痛 大鼠 永生化嗜铬细胞 Eaton et al,1999 癌痛 人 微囊化牛嗜铬细胞 Buchser et al,1996 癌痛 人 人肾上腺髓质 AtT-20/hENK cells / Bes et al,1998 急性痛 大鼠 0 -内啡肽和甲啡肽 Neuro2A/POMC cells / Wuet al,1994 急性痛 大鼠 0 - 内啡肽 Saitoh et al,1995 神经痛 大鼠 RN46A-B14 细胞/ 5-HT/BDNF Eaton et al,1997 神经痛 大鼠 33GAD 细胞 / GABA Eaton et al,1999 神经痛 大鼠 33GAL 细胞/ 甘丙肽 Eaton et al,1999 炎性痛 大鼠 P19/ hENK cells / 0 -内啡肽 Ishii et al, 2000 神经痛 大鼠 33BDNF 细胞/ BDNF Cejas et al,2000 神经痛 大鼠 永生化/去永生化嗜铬细胞 Eaton et al,2002 炎性痛 大鼠 嗜铬细胞 / hENK cells / 阿片肽 Duplan et al, 2004 神经痛 大鼠 IAST/GAL/ 甘丙肽 Tian YK et al,2005 神经痛 大鼠 IAST/hPPE/ 脑啡肽 Tian YK et al,2005 1.4 存在的问题 虽然移植细胞可以分泌各种纯天然的肽类神经递质，比人工合成的肽类物质半衰期长，但这种方法也存 在着若干缺陷，如①机体对移植细胞的免疫排斥反应；②移植细胞致瘤性的危险；③转基因表达的不稳定性； ④缺乏组织和细胞的特异性；⑤非特异性瘢痕形成；⑥需要复杂的手术操作等问题。 2、直接体内疗法(In vivGene Therapy)该方法是将治疗基因导入体内，改变与修复机体的遗传物质，以 此特异性地干预疼痛的生物学行为，达到治疗目的。该方法主要有两个治疗方向，即上调抗痛基因的表达 (up-regulation antinociception)和下调致痛基因的表达(knockdown nociception)。目前对其研究日益增多， 可能将成为疼痛基因治疗最有前途的方法。 2.1 上调抗痛基因表达 利用基因重组技术将一些抗痛基因、调控因子基因或受体基因等外源基因插入载体基因组，加上启动子， 导入神经细胞，促进抗痛基因的表达。一般认为初级传入神经细胞和脊髓背角的神经细胞是较为安全和可行 的治疗靶点。 2.1.1 载体的选择 目前用作基因治疗的载体主要有非病毒载体和病毒载体，前者包括裸DNA、脂质体、多聚物以及分子耦 联体。非病毒载体具有以下优点①安全，无传染性；②不限制载体容量；③可大量制备；④无免疫原性；⑤ 无DNA重组。但非病毒载体也存在不足之处如①导入效率低；②表达水平低且短暂；③无特异靶细胞；④ 体内易被降解。由于携带目的基因的靶向高效表达是基因治疗成功的关键，所以目前广泛采用病毒载体作为 转基因的手段。病毒载体主要来源于鼠和人类的DNA、RNA病毒，最常用的以腺病毒(Adenovirus)、腺相 关病毒(Adeno-associated virus)、逆转录病毒(Retrovirus)和单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus)为多， 这几种经过改造的病毒载体的主要特性见表2。 表 2 常用病毒载体的主要特性 载体特征 腺病毒 腺相关病毒 逆转录病毒 单纯疱疹病毒 病毒基因组 双链 DNA 单链 DNA 单链 RNA 双链 DNA 基因组大小 30-36kb 4.7-6kb 8-11kb 152kb 是否整合 否 是 是 否 插入外源基因大小 <7.5kb <4.7kb <5kb <35kb 是否感染非分裂期细胞 是 是 否 是 病毒蛋白表达 是 否 否 潜在 外源基因表达 短暂(days-weeks) 长久(m onth) 长久(m onth-years) 短暂(days-weeks) 2.1.2 应用 上调抗痛基因表达在疼痛研究中的应用详见表3。 表 3 上调抗痛基因表达在慢性疼痛的治疗 外源基因 载体类型 疼痛类型 参考文献 B -endorphin 腺病毒 炎性痛 Finegold et al,1999 POMC 基因枪 炎性痛 Lu et al,2002 POMC 裸质粒 神经痛 Lin et al ,2002 Interleukin-2 裸质粒 神经痛 Yao et al, 2002 Interleukin-10 腺病毒 炎性痛 Milligan et al, 2002 BDNF 腺相关病毒 神经痛 Eaton et al, 2002 NT-3 腺相关病毒 神经痛 Chattopadhyay et al,2002 pEnkA 单纯疱疹病毒 神经痛 Hao et al, 2003 MOR 腺相关病毒 炎性痛 Xu et al ,2003 NGF 腺相关病毒 神经痛 Chattopadhyay et al,2003 POMC 电穿孔 神经痛 Wu et al ,2004 GDNF 腺相关病毒 神经痛 Hao et al, 2004 hPPE 腺相关病毒 神经痛 Tian YK,et al,2005 注：POMC=阿片黑皮质素原；pEnkA=脑啡肽原A; BDNF=脑源性神经营养因子; 3 2.2 下调致痛基因的表达 降低神经系统内内源性致痛分子的表达同样可以达到镇痛的目的。目前基因治疗中常用的技术有反义寡 核苷酸技术(antisense oligonucleotides, ASO)和 RNA 干扰技术(RNA interference, RNAi)。 2.2.1反义寡核苷酸技术 反义寡核苷酸技术是将与靶基因序列互补的小分子寡核苷酸DNA (约18-20个核苷酸)导入细胞，与 mRNA结合，通过①核酸酶H降解(RNase H degradation)；②阻断翻译(translational blockade)和③剪切 捕获(splicing arrest)。后两种机制通常又称为空间抑制(steric inhibition)0 反义寡核苷酸技术具有①与传统的药物治疗相比，ASO具有高度的特异性；②而且寡核苷酸分子的设计 和合成也较为容易。③另外与病毒颗粒相比，ASO鞘内给药可以不受边缘胶质细胞的限制而容易弥散至脊髓 实质；④ASO具有较小的免疫原性；⑤不会产生潜在毒性的病毒蛋白；⑥对非分裂细胞亦有效；⑦ASO不 会整合至宿主细胞基因组DNA中，消除了导致基因组变异的可能性。虽然ASO抑制靶DNA的方法看似简 单，但是ASO的游离和应用的实现比预想的要困难得多，这些困难主要包括①合适活性寡聚体的游离较难; ②存在寡核苷酸的特异性与差异性；③ASO结合胞内目标mRNAs的途径复杂；④未知非反义效应的发生； ⑤毒性反应(包括免疫刺激引起的淋巴组织增生、脾肿大、多器官单核细胞浸润以及补体激活；血小板减少 症导致的凝血时间延长；肝转氨酶升高等)。 2.2.2 RNA干扰技术 RNAi是近几年才发展起来的技术，是将小片段双链RNA (siRNA)导入细胞，siRNA结合一个核酶复合 物从而形成RNA诱导沉默复合物(RISC)，激活的RISC通过碱基配对定位到mRNA转录本上，并在距离 siRNA3'端12个碱基的位置上切割mRNA，介导同源序列mRNA的特异性降解，从而导致基因沉默现象。因 RNAi所致的基因沉默发生在转录水平，所以又被称为转录后基因沉默(PTGS)。 RNAi具有以下显著特征：①高特异性；②高效性；③长度限制性；④可传播性；⑤ATP衣赖性。由于 RNA干扰技术具有操作简单、效率高、基因关闭效果出现快等特点，使之成为基因治疗研究的重要工具。2004 年Dorn［25］和2005年Tan【26］等利用RNAi技术分别针对疼痛信号传递通路中P2X3嘌吟受体和NMDA受体2B亚 基作了探索性的动物实验研究，结果证实RNA i比ASO的镇痛作用更加有效。 但RNA干扰技术尚存在一些问题，如①一些基因或组织可能存在具有抵抗RNA干扰的能力；②dsRNA序 列选择不同可能导致不同的抑制效果，并且只能在外显子序列中选择；③在哺乳动物中诱原NA干扰必须是 21个碱基左右的siRNA，而且其抑制效果不如在低等生物中；④RNA干扰对稳定、丰富表达的靶基因抑制效 率不高；⑤寡聚核酸合成困难，易被降解以及细胞摄取效率低等。 2.2.3 应用 目前将ASO和RNA i技术用于疼痛研究的报道不多，现总结于表4。 表4・ASO和RNAi在疼痛基因治疗中的应用 ASO/RNAi 目的基因 疼痛类型 动物 References ASO c-fos 炎性痛 大鼠 Hou et al,1997 ASO 神经激肽 1 受体 炎性痛 大鼠 Hua et al ,1998 ASO NMDA 受体 NR1、NR2C、NR2D 亚基 炎性痛 大鼠 Garry et al,2000 ASO 神经营养因子-3 神经痛 大鼠 White DM,2000 ASO P2X3 嘌呤受体 炎性痛 神经痛 大鼠 Honore ,et al,2002 Barclay et al,2002 ASO 河豚毒不敏感性钠通道 NaV 1.8 神经痛 大鼠 Laiet al,2002 ASO 代谢型谷氨酸受体 炎性痛 神经痛 大鼠 Fundytus et al2002 Sharif et al, 2002 ASO B -Arrestin 神经痛 大鼠 Przewlocka et al, 2002 ASO 蛋白激酶C Y 神经痛 大鼠 Luo AL,et al,2005 RNAi P2X3嘌吟受体 神经痛 大鼠 Dorn G et al, 2004 RNAi NMDA受体 NR2B 亚基 炎性痛 大鼠 Tan PH et al,2005 RNAi 香草受体-1 神经痛 大鼠 Christoph T et al, unpublished data 3、结语 慢性疼痛的基因治疗是近几年提出的概念，现在尚处于实验室研究阶段，如何解决好目的基因的靶向性、 可诱导性以及安全性是这一研究领域的关键问题，但随着人们在分子和细胞水平、神经递质及离子通道等多 方面对疼痛发生机制认识的不断深入，可以相信在不久的将来疼痛治疗必将进入个体化、靶向性强、高效性 且安全的新时代，为疼痛的治疗提供美好的前景。