发酵液中分离提纯透明质酸

发酵液中分离提纯透明质酸 摘要:透明质酸微生物发酵液中往往都含有蛋白质、核酸等杂质, 因此需要分离纯化。只有高纯度的透明质酸才能更好的发挥其工业效 用，但是分离纯化的方法却多种多样。目前主要方法有过滤法、凝胶 层析法、离子交换层析法等，而不同的方法又将导致操作、成本、和 纯度的不同。因此本文将从多方面多角度综合分析各种透明质酸分离 纯化方法。 关键词:透明质酸 多糖 发酵 分离提纯 过滤 凝胶层析 离子交换 透明质酸（Hyaluronic acid，简称HA）又名玻璃酸，是一种由D-N-乙 酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸为结构单元的酸性高分子粘多糖。HA 具有许多天然多糖共有的性质:呈白色,为无定形固体，无臭无味，有强 吸湿性，溶于水，不溶于有机溶剂。它是一种国际上公认的生物大分子 保湿剂，用于眼科显微手术、关节炎治疗、高档化妆品、食品添加剂 等领域⑴。 1分离提纯透明质酸 发酵法生产的HA具有分离精制容易，保湿性强，品质稳定,产量大 等优点，目前已得到广泛使用,并已成为研究HA生产的主要方向。由 于微生物发酵液中提取的透明质酸粗品都含有菌体,杂蛋白、核酸等 杂质,需要进一步分离纯化。以下简单介绍几种工业上常用的发酵液 中透明质酸的分离提纯的方法。 1.1过滤法 过滤法分离纯化发酵液中的HA是一种简单有效并可以规模化 生产HA的分离纯化方法，可以有效地除去菌体和杂蛋白，对分子量的 影响相对较小。邓禹等［2］采用25g/L三氯乙酸灭活菌体并使蛋白质变 性沉淀,以发酵液质量1.2%的混合硅藻土为过滤助剂，过滤温度为 60°C,pH为7.0的透明质酸发酵液预处理工艺，完全去除了透明质酸发 酵液中的菌体和蛋白质等杂质。采用这一工艺得到的成品透明质酸中 葡萄糖醛酸含量达46.39%,蛋白质含量仅为0.047%,分子量为190万, 提取收率为91.3%。这种方法利用三氯乙酸灭活菌体并使蛋白质变性 沉淀，然后以硅藻土作为过滤助剂吸附、截留蛋白质和菌体的透明质 酸发酵液预处理方法。 1.2凝胶层析法 凝胶层析法是生物化学中一种常用的分离手段，凝胶层析是依据 不同分离纯化目的和HA分子量大小选择合适的分子筛进行分离纯 化的，透明质酸分子量达几十万到几百万,而蛋白质的分子量仅为几万, 所以选择合适的凝胶可以起到分离纯化的效果。吴华昌等 ⑶采用葡 聚糖凝胶G-100,以0.1mol/L氯化钠溶液为洗脱剂，以HA提取率与纯 度为指标，对HA发酵液进行分离纯化，再用醇沉法提取HA,拟达到提 高HA提取率和纯度的目的。在优化的凝胶层析条件下,HA提取率达 到79.85%,蛋白质去除率为84.93%。 1.3离子交换层析法 如果采用化学方法从发酵液中分离纯化透明质酸，纯化过程中的 pH值、光、热和还原剂等因素易导致其黏度发生不可逆的下降。而 在进入HA纯化阶段后，由于离子交换层析等具有选择性吸附特点的 层析技术已经成为分离提取生物大分子的有效方法。倪杭生等［4］采 用强酸型阳离子树脂为交换剂的离子交换柱，和经组氨酸基团修饰的 强碱型阴离子树脂为交换剂的离子交换层析柱串联。选择以氯化钠溶 液为洗脱剂,在优化的洗脱条件下，对HA粗品进行分离纯化，纯化重量 收率为58%〜61%，分子量近100万。HA粗品溶液先通过交换柱，其中 主要杂质蛋白质是两性物质，在偏酸性溶液中带正电荷，能与强酸型阳 离子发生交换吸附而被纯化。 2透明质酸分离提纯方法的分析总结 从发酵液中分离提纯透明质酸是发酵法生产透明质酸的关键步 骤之一，而目前报道的去除HA发酵液中菌体和蛋白质等杂质的方法 有过滤法、凝胶层析法、离子交换层析法等。虽然过滤法具有设备简 单、操作方便、试验重复性好、成本低廉，且能有效去除蛋白质类杂 质，但提纯效率相对还是比较低的,这种方法通常只用于透明质酸的初 期分离纯化。凝胶层析是基于被分离组分之间的分子量大小不同而起 到分离的效果，这样就避免了化学方法纯化HA过程中的pH、酶、光、 热和还原剂等因素导致糖苷键的水解或分子间解聚，避免了黏度发生 不可逆的下降。但凝胶层析法成本较高，且分离提纯HA的提取率也 比较低。离子交换法基于被分离组分与交换剂之间存在的静电作用, 离子交换层析分离条件温和，不引起分子结构的变化，这具有很强的优 越性。与化学提取法相比，离子交换法的提取率还较低,离子交换树脂 的化学修饰比较困难，因此在离子交换剂的选择以及离子交换树脂的 基团修饰方面还需要进一步的研究。面对这诸多问题每种分离纯化方 法也都存在一定的局限性,单一的分离纯化方法并不能达到很高的纯 化程度，只有根据制备HA的不同要求在不同阶段选择适当的分离纯 化的方法,并对工艺过程和方法进行系统优化，才能获得高纯度、高分 子量的HA。因此从发酵液中分离纯化HA往往是由多种分离纯化方 法联合完成。所以，对于发酵液中透明质酸的提取方法还有待于进一 步的研究探索。 3透明质酸展望 2004年全球的HA在化妆品和医疗用途上,销售总值高达30〜40 亿美元，还以每年20%的递增率增长。在HA的研发上,国内外学者开 始着重于对HA进行修饰及对其衍生物的应用进行研究，以解决纯HA 易溶于水、吸收迅速和在组织中停留时间短等特性。在HA分离提纯 工艺研究的重点将是对分离纯化方法优化组合，精细化操作，降低生产 成本的同时提高分离纯化工艺的安全性，操作上的简捷性，探索适合于 工业化生产的工艺路线,在提高HA纯度的同时尽量保持高的分子量。 因此,HA的研发以及纯化工艺的改进将成为当前的发展趋势。 参考文献 [1] 孙尚志，张青春，张辉，等.透明质酸(HA)的功能和生产进展[J]. 长春中医药大学学报，2007,23(3)88〜89. [2] 邓禹，堵国成,李秀芬，等.基于发酵液特性的透明质酸提取预 处理工艺[J].过程工程学报,2007,7(2)380〜384. [3] 吴华昌，马钦元，等.凝胶层析在发酵液中分离提纯透明质酸中 的应用[J].生物技术通报,2009,12:184〜187. [4] 倪杭生，李润,贺艳丽，等.透明质酸的离子交换层析纯化[J].中 国医药工业杂志,2001,32(11):485〜488.