免疫细胞功能检测技术

第十五章 免疫细胞功能检测技术 免疫细胞是指参与机体免疫应答的细胞，大致可分为两类，一类能识别特异性抗原，一旦被激活则显 示出特异性应答的功能，主要指淋巴细胞群，包括T细胞、B细胞、NK细胞、K细胞等；另一类能捕获抗原， 处理抗原，以一定方式提呈给淋巴细胞或表现其他免疫功能，包括中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。 测定这些细胞功能可以有效评价机体特异性和非特异性免疫功能。 第一节 淋巴细胞的功能检测 淋巴细胞功能测定可分为体内试验和体外试验。 体内试验主要是进行迟发型超敏反应，借此间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反 应； 体外试验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产 物的测定。 一、T细胞功能检测 T细胞具有多种免疫生物学功能，如直接杀伤靶细胞、辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原或丝 裂原刺激产生增殖反应及产生各种细胞因子。据此，建立了一系列检测T细胞功能的体内和体外试验。 （一） T细胞增殖试验 1•原理：T细胞在体外受到有丝分裂原或抗原的刺激后，细胞增殖，并转化为淋巴母细胞。因此，淋巴 细胞增殖反应又称淋巴母细胞转化。 2.刺激物：植物血凝素（PHA）、刀豆素A （ConA）和美洲商陆（PWM）、白喉类毒素、破伤风类毒素、 纯化蛋白衍生物（PPD）和白色念珠菌等。 3•方法学：检测T细胞增殖反应的方法有： （1） 形态学检查法：运用普通光学显微镜，简便易行。缺点是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易 受主观因素影响，重复性和准确性较差。 （2） 3H-TdR掺入法：敏感性高，客观性强，重复性好，但需一定设备条件，及存在放射性核素污染问 题。 （3） MTT比色法：本方法的敏感性虽不及'3H-TdR掺入法，但操作简便，无放射性污染。较常釆用。 （二） T细胞分泌功能测定 体外培养的 T 细胞经各种丝裂原或抗原刺激后，分泌各种细胞因子，可借助免疫学、细胞生物学及分 子生物学技术通过对于T细胞分泌细胞因子的含量、生物学活性和基因表达水平，以反映T细胞功能。 （三） T细胞介导的细胞毒试验 常选用可传代的已建株的人肿瘤细胞，与待检淋巴细胞混合，观察肿瘤细胞杀伤的情况。一是评价机体 细胞免疫水平的常用指标，特别是测定肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力，常作为判断预后和观察疗效的 指标之一。 （四） 体内实验 正常机体对某种特殊抗原建立了细胞免疫后，如用相同的抗原做皮肤试验，常可出现阳性的迟发型超 敏反应。目前临床上常用于诊断某些病原微生物感染（结核、麻风等）和细胞免疫缺陷等疾病，也常用于 观察细胞免疫功能在治疗过程中的变化及判断预后等。 1. 特异性抗原皮肤试验：常用的特异性抗原皮肤试验为结核菌素皮肤试验。其他皮试抗原还有白色念 珠菌素、皮肤毛癣菌素、腮腺炎病毒等。受试者对所试抗原过去的致敏情况直接影响试验结果。若受试者 从未接触过该抗原，则不会出现阳性反应，因此阴性者也不一定表明细胞免疫功能低下。为避免判断错误， 往往需用两种以上抗原进行皮试，综合判断结果。 2. PHA皮肤试验：将定量PHA注射到受试者前臂皮内，可非特异性刺激T细胞发生母细胞转化，呈现以 单个核细胞浸润为主的炎性反应o PHA皮肤试验敏感性高，比较安全可靠，临床常用于检测机体的细胞免疫 水平。 二、 B细胞功能检测 B细胞主要产生Ig参与机体体液免疫应答，B细胞功能低下或缺乏者对外源性抗原刺激的应答能力减 弱或缺陷，特异性抗体产生减少或缺如。因此，B细胞功能试验方法有受试者血清Ig含量检测和体外B细 胞增殖和产生抗体能力检测等。 （一） B细胞增殖试验：原理与T细胞增殖试验相同，但刺激物不同，小鼠B细胞可用细菌脂多糖（LPS） 作为刺激物，人则用含SPA的金黄色葡萄球菌菌体及抗IgM抗体等刺激。 （二） 溶血空斑试验 1•原理：将SRBC免疫的小鼠脾脏（或家兔淋巴结）制成单个细胞悬液，与SRBC在琼脂糖凝胶内混合 后倾注于小平皿或玻片上。脾细胞中的抗体生成细胞释放抗SRBC抗体，使其周围的SRBC致敏，在补体参 与下可将SRBC溶解，形成肉眼可见的溶血空斑。每一个空斑中央含一个抗体形成细胞，空斑数目即为抗体 形成细胞数。空斑大小表示抗体形成细胞产牛抗体的多少。 2. 方法学 （1） 经典溶血空斑形成试验：用于检测实验动物抗体形成细胞的功能。可分为直接法和间接法。直接 法所测到的细胞为IgM类抗体形成细胞，其他类型的Ig由于溶血效应较低，不能直接检测；间接法，即在 小鼠脾细胞和SRBC混合时，再加抗鼠Ig抗体（如兔抗鼠Ig），使抗体产生细胞所产生的IgG或IgA与抗 Ig抗体结合成复合物，此时能活化补体导致溶血。上述直接法和间接法都只能检测抗RBC抗体的产生细胞， 而且需要事先免疫，难以检测人类的抗体产生情况。 （2） 被动溶血空斑试验：是指抗体形成细胞产生的Ig与SRBC上的抗原结合，在补体参与下出现溶血 反应。方法是将吸附有已知抗原的SRBC、待检B细胞、补体及适量琼脂糖液混合，倾注平皿，温育1〜3小 时后，形成肉眼可见的溶血空斑。这种非红细胞抗体性溶血空斑试验可检测SRBC 上抗原相应的抗体形成细 胞，因此应用范围较广 3. 临床应用与评价：溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响，评价免疫 治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。 （三） 酶联免疫斑点试验（ELISPOT） 1•原理：用抗原包被固相载体，加入待检的抗体产生细胞，即可诱导抗体的分泌。分泌的抗体与包被 抗原结合，在抗体分泌细胞周围形成抗原抗体复合物，使细胞吸附于载体上，加入酶标记的第二抗体与细 胞上的抗体结合，通过底物显色反应的深浅，可测定出生成的抗体量，并可在镜下计数着色的斑点形成细 胞。 2.应用与方法学评价 该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。.其优点是稳定、特异、抗原用量少：可同时检 测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。 （四） 体内实验 B细胞功能减低或缺陷，可表现为体内Ig和血型抗体量下降或缺如。常用于体内抗体产生的特异性抗 原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。将适量抗原皮下或肌内注射免疫，并于免疫前 及免疫后1、2、3周分别釆血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B细胞 的功能。 三、 NK细胞活性测定 NK细胞具有ADCC，能直接杀伤肿瘤细胞，故将单个核细胞与肿瘤细胞共同培养，肿瘤细胞存活率低， NK细胞的活性则高 测定人NK细胞活性的靶细胞多用K562细胞株，而测定小鼠NK细胞活性则常釆用YAC-1 细胞株。 体外检测 NK 细胞活性的方法有形态学法、酶释放法、放射性核素释放法、化学发光法、流式细胞术法 等。 第二节 吞噬细胞功能检测技术 大吞噬细胞：包括血液中的大单核细胞及其讲入各种组织后发育而成的巨噬细胞及树突状细胞等。 功能：①非特异性地吞噬杀灭病原体、衰老病残和突变的细胞；②在特异性免疫形成过程中，参与抗 原识别和递呈，生成多种细胞因子，参与迟发型变态反应和多种自身免疫性疾病的病理损伤。 小吞噬细胞：中性粒细胞。 功能：以吞噬功能为主，发挥非特异性免疫防疫作用并参与机体的免疫应答炎症损伤等。吞噬细胞的 吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。 一、 中性粒细胞功能检测 （一） 趋化功能检测 1.原理：中性粒细胞在趋化因子如微生物的细胞成分及其代谢产物、补体活性片段（C5a、C3a）、某 些细胞因子等作用下产生趋化运动，其趋化运动强度可反映中性粒细胞的趋化功能。 2•方法学：（1）滤膜渗透法（Boyden小室法）；（2）琼脂糖平板法。 （二） 吞噬和杀菌功能测定 1. 显微镜检杳法：将白细胞与葡萄球菌或白色念珠菌悬液混合温育，涂片，固定,碱性亚甲蓝液染色。 油镜下计数吞噬细菌和未吞噬细菌的白细胞数。对有吞噬作用的白细胞，应同时记录所吞噬的细菌数。 2. 溶菌法：将白细胞悬液与经新鲜人血清调理过的细菌（大肠杆菌或金黄色葡萄球菌）按一定比例混 合，温育。每隔一定时间取定量培养物，稀释后接种固体平板培养基°37°C培养18小时后，计数生长菌落 数，以了解中性粒细胞的杀菌能力。 3. 硝基四氮唑蓝还原试验（NB T还原试验）。 二、 巨噬细胞功能检测 人巨噬细胞一般从外周血或经斑蝥敷贴形成的皮泡液中获取，也可从肺泡灌洗液或患者腹膜透析液中 分离。实验室研究中常用小鼠腹腔巨噬细胞。 （一） 炭粒廓清试验 （二） 吞噬功能检测 巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，常用鸡红细胞（CRBC）、白色念珠菌、酵母细胞等 作为吞噬颗粒。将巨噬细胞与鸡红细胞悬液在体外混合，温育，涂片，染色，油镜下观察、计数，通过计 算吞噬率和吞噬指数来反映巨噬细胞的吞噬功能，并通过观察鸡红细胞的消化程度，判断巨噬细胞消化功 能。 （三） 巨噬细胞溶酶体酶的测定 巨噬细胞富含溶酶体酶，如酸性磷酸酶、非特异性酯酶和溶菌酶等，测定这些酶的活性也是衡量巨噬 细胞功能的指标之一。 （四） 细胞毒作用的测定 （五） 巨噬细胞促凝血活性测定 第三节 免疫细胞功能检测的临床应用 免疫细胞功能检测可以反映机体免疫功能状态，同时还可用于肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和预后 监测。如免疫细胞的功能试验可帮助免疫缺陷病的诊断；肿瘤患者的细胞免疫功能状态监测有助于了解肿 瘤的发展与预后判断；组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于排斥反应的早期发现，以便 及时采取有效措施。 用斑蝥敷贴法可以从人体组织液中获取较纯的 A. 巨噬细胞 B. B 细胞 C. T 细胞 D. 粒细胞 E. 浆细胞 『正确答案』A 『答案解析』人巨噬细胞一般从外周血或经斑蝥敷贴形成的皮泡液中获取，也可从肺泡灌洗液或患者 腹膜透析液中分离。 检测巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数常采用 A. NBT 还原试验 B. 杀菌试验 C. 斑螯发泡试验 D. 趋化试验 E. 鸡红细胞吞噬试验 『正确答案』E 『答案解析』吞噬功能检测：巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能,常用鸡红细胞（CRBC）、 白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒。将巨噬细胞与鸡红细胞悬液在体外混合，温育，涂片，染色, 油镜下观察、计数，通过计算吞噬率和吞噬指数来反映巨噬细胞的吞噬功能，并通过观察鸡红细胞的 消化程度，判断巨噬细胞消化功能。 滤膜小室法是检测哪种细胞趋化运动的功能 A. 巨噬细胞 B. 中性粒细胞 C. T 细胞 D. B 细胞 E. 浆细胞 『正确答案』B 『答案解析』中性粒细胞趋化功能检测方法学：滤膜渗透法（Boyden小室法）；琼脂糖平板法。 溶血空斑试验检测的是 A. T 淋巴细胞 B. 巨噬细胞 C. NK 细胞 D. B 淋巴细胞 E. LAK 细胞 『正确答案』D 『答案解析』B细胞功能检测包括B细胞增殖试验和溶血空斑试验。