《酶和细胞固定化》PPT课件

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1、Chapter 5 Immobilized Enzyme and Cell固 定 化 酶 和 细 胞 制 作 ： 郑 穗 平 酶 应 用 过 程 中 的 一 些 不 足l 酶 的 稳 定 性 较 差 ： 除 了 某 些 耐 高 温 的 酶 ， 如 -淀 粉 酶 、 Taq酶 等 ； 和胃 蛋 白 酶 等 可 以 耐 受 较 低 的 pH条 件 以 外 ， 大 多 数 的 酶 在 高 温 、 强 酸 、强 碱 和 重 金 属 离 子 等 外 界 因 素 影 响 下 ， 都 容 易 变 性 失 活 。 l 酶 的 一 次 性 使 用 ： 酶 一 般 都 是 在 溶 液 中 与 底 物 反 应 ，

2、这 样 酶 在 反 应 系统 中 ， 与 底 物 和 产 物 混 在 一 起 ， 反 应 结 束 后 ， 即 使 酶 仍 有 很 高 的 活 力 ，也 难 于 回 收 利 用 。 这 种 一 次 性 使 用 酶 的 方 式 ， 不 仅 使 生 产 成 本 提 高 ，而 且 难 于 连 续 化 生 产 。 l 产 物 的 分 离 纯 化 较 困 难 ： 酶 反 应 后 成 为 杂 质 与 产 物 混 在 一 起 ， 无 疑 给产 物 的 进 一 步 的 分 离 纯 化 带 来 一 定 的 困 难 。 固 定 化 技 术 Contents of chapter 51、 什 么 是 固 定 化 技

3、术 和 固 定 化 酶2、 固 定 化 酶 的 研 究 历 史3、 酶 的 固 定 化 技 术4、 固 定 化 酶 的 特 点GoGoGoGo 6、 细 胞 、 原 生 质 体 的 固 定 化 ， 自 学5、 固 定 化 酶 的 应 用Go 5.1 什 么 是 固 定 化 酶 ？水 溶 性 酶 水 不 溶 性 载 体水 不 溶 性 酶（ 固 定 化 酶 ）固 定 化 技 术 化 学 偶 联酶 固 定 化间 歇可 溶 交 联包 埋吸 附 间 歇 连 续酶 的 固 定 化 技 术 和 固 定 化 酶 固 定 化 酶 ： 经 提 取 和 分 离 纯 化 后 的 酶 固 定 化 菌 体 (死 细 胞

4、)： 含 酶 菌 体 或 菌 体 碎 片 固 定 化 细 胞 ： 在 一 定 的 空 间 范 围 内 进行 生 命 活 动 的 细 胞 l 优 点 ：1.不 溶 于 水 ， 易 于 与 产 物 分 离 ；2.可 反 复 使 用 ；3.可 连 续 化 生 产 ；4.稳 定 性 好 。l 缺 点 ：固 定 化 过 程 中 往 往 会 引 起 酶 的 失 活 本 章目 录 l 固 定 化 酶 的 研 究 从 50年 代 开 始 ， 1953年 德 国 的 Grubhofer和 Schleith采 用 聚 氨 基 苯 乙 烯 树 脂 为 载 体 与 羧 肽 酶 、 淀 粉 酶 、 胃 蛋 白 酶 、

5、核 糖 核酸 酶 等 结 合 ， 制 成 固 定 化 酶 。l 60年 代 后 期 ， 固 定 化 技 术 迅 速 发 展 起 来 。 1969年 ， 日 本 的 千 烟 一 郎 首次 在 工 业 上 生 产 应 用 固 定 化 氨 基 酰 化 酶 从 DL-氨 基 酸 连 续 生 产 L-氨 基酸 ， 实 现 了 酶 应 用 史 上 的 一 大 变 革 。l 在 1971年 召 开 的 第 一 次 国 际 酶 工 程 学 术 会 议 上 ， 确 定 固 定 化 酶 的 统 一英 文 名 称 为 Immobilized enzyme。5.2 固 定 化 酶 的 研 究 历 史 l 随 着 固

6、定 化 技 术 的 发 展 ， 出 现 固 定 化 菌 体 。 1973年 ， 日 本 首 次 在工 业 上 应 用 固 定 化 大 肠 杆 菌 菌 体 中 的 天 门 冬 氨 酸 酶 ， 由 反 丁 烯 二 酸连 续 生 产 L-天 门 冬 氨 酸 。l 在 固 定 化 酶 和 固 定 化 菌 体 的 基 础 上 ， 70年 代 后 期 出 现 了 固 定 化 细 胞技 术 。 1976年 ， 法 国 首 次 用 固 定 化 酵 母 细 胞 生 产 啤 酒 和 酒 精 ，1978年 日 本 用 固 定 化 枯 草 杆 菌 生 产 淀 粉 酶 ， 开 始 了 用 固 定 化 细 胞 生产 酶

7、的 先 例 。l 1982年 ， 日 本 首 次 研 究 用 固 定 化 原 生 质 体 生 产 谷 氨 酸 ， 取 得 进 展 。固 定 化 原 生 质 体 由 于 解 除 了 细 胞 壁 的 障 碍 ， 更 有 利 于 胞 内 物 质 的 分泌 ， 这 为 胞 内 酶 生 产 技 术 路 线 的 变 革 提 供 了 新 的 方 向 。 本 章目 录 5.3 酶 固 定 化 技 术l 活 性 中 心 ： 保 护 酶 的 催 化 作 用 ， 并 使 酶 的 活 性 中 心 的 氨 基 酸 基 团固 有 的 高 级 结 构 不 受 到 损 害 ， 在 制 备 固 定 化 酶 时 ， 需 要 在

8、非 常 严密 的 条 件 下 进 行 。l 功 能 基 团 ： 如 游 离 的 氨 基 、 羧 基 、 半 胱 氨 酸 的 巯 基 、 组 氨 酸 的 咪唑 基 、 酪 氨 酸 的 酚 基 、 丝 氨 酸 和 苏 氨 酸 的 羟 基 等 ， 当 这 些 功 能 基团 位 于 酶 的 活 性 中 心 时 ， 要 求 不 参 与 酶 的 固 定 化 结 合l 酶 的 高 级 结 构 ： 要 避 免 用 高 温 、 强 酸 、 强 碱 等 处 理 ， 而 且 有 机 溶剂 、 高 浓 度 的 盐 也 会 使 酶 变 性 、 失 活 ， 因 此 ， 操 作 应 尽 量 在 非 常温 和 的 条 件 下

9、 进 行 。固 定 化 酶 操 作 的 注 意 事 项 1、 吸 附 法 利 用 各 种 固 体 吸 附 剂 将 酶 或 含 酶菌 体 吸 附 在 其 表 面 上 ， 而 使 酶 固 定 化的 方 法 。 常 用 的 固 体 吸 附 剂 有 活 性 炭 、 氧化 铝 、 硅 藻 土 、 多 孔 陶 瓷 、 多 孔 玻 璃 、硅 胶 、 羟 基 磷 灰 石 等 。 操 作 简 便 ， 条 件 温 和 ， 不 会 引 起酶 变 性 失 活 ， 载 体 廉 价 易 得 ， 而 且 可反 复 使 用 。 由 于 靠 物 理 吸 附 作 用 ， 结 合 力 较 弱 ， 酶 与 载 体 结 合 不 牢 固

10、 而 容 易 脱 落 ，所 以 使 用 受 到 一 定 的 限 制 。 2、 包 埋 法 将 酶 或 含 酶 菌 体 包 埋 在 各 种 多 孔 载 体 中 ， 使 酶固 定 化 的 方 法 。 包 埋 法 使 用 的 多 孔 载 体 主 要 有 ： 琼 脂 、 琼 脂糖 、 海 藻 酸 钠 、 角 叉 菜 胶 、 明 胶 、 聚 丙 烯 酰 胺 、光 交 联 树 脂 、 聚 酰 胺 、 火 棉 胶 等 。根 据 载 体 材 料 和 方 法 的 不 同 ， 可 分 为 ：凝 胶 包 埋 法 ： 将 酶 或 含 酶 菌 体 包 埋 在 各 种 凝 胶 内 部 的 微 孔 中 ， 制 成 一 定形

11、 状 的 固 定 化 酶 或 固 定 化 含 酶 菌 体 。 大 多 数 为 球 状 或 片 状 ， 也 可 按 需 要制 成 其 他 形 状 。 常 用 的 凝 胶 有 琼 脂 凝 胶 、 海 藻 酸 钙 凝 胶 、 角 叉 菜 胶 、 明胶 等 天 然 凝 胶 以 及 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 、 光 交 联 树 脂 等 合 成 凝 胶 。 半 透 膜 包 埋 法 ： 将 酶 包 埋 在 由 各 种 高 分 子 聚 合 物 制 成 的 小 球 内 ， 制 成 固定 化 酶 。 常 用 于 制 备 固 定 化 酶 的 半 透 膜 有 聚 酰 胺 膜 、 火 棉 胶 膜 等 首 先 被 采

12、用 包 埋 法 的 是 ： 固 定 化 胰 蛋 白 酶 木 瓜 蛋 白 酶 淀 粉 酶Enzyme+N,N-甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 ， 丙 烯 酰 胺 ， 引 发 剂 海 藻 酸 钙包 埋 法 装 置将 水 溶 性 的 海 藻 酸 钠 配 成 水 溶 液 ，并 把 酶 或 细 胞 分 散 在 其 中 ， 然 后 将其 滴 入 凝 固 浴 中 （ 常 用 CaCl2 溶液 ） ， 使 海 藻 酸 钠 中 的 Na+， 部 分被 Ca2+所 取 代 而 形 成 由 多 价 离 子 交联 的 离 子 网 络 凝 胶 。颗 粒 大 小 可 实 时 监 控 脂 质 体 包 裹 3、 结 合 法 选

13、择 适 宜 的 载 体 ， 使 之 通 过 共 价 键 或 离 子 键 与 酶 结 合 在 一 起的 固 定 化 方 法 。根 据 酶 与 载 体 结 合 的 化 学 键 不 同 ， 可 分 为 ：离 子 键 结 合 法 ： 通 过 离 子 键 使 酶 与 载 体 结 合 的 固 定 化 方 法 称 为 离 子键 结 合 法 。 离 子 键 结 合 法 所 使 用 的 载 体 是 某 些 不 溶 于 水 的 离 子 交 换剂 。 常 用 的 有 DEAE-纤 维 素 、 TEAE-纤 维 素 、 DEAE-葡 聚 糖 凝 胶 等 。 共 价 键 结 合 法 ： 通 过 共 价 键 将 酶 与

14、载 体 结 合 的 固 定 化 方 法 称 为 共 价 键 结合 法 。 共 价 键 结 合 法 所 采 用 的 载 体 主 要 有 ： 纤 维 素 、 琼 脂 糖 凝 胶 、 葡 聚 糖凝 胶 、 甲 壳 质 、 氨 基 酸 共 聚 物 、 甲 基 丙 稀 醇 共 聚 物 等 。酶 分 子 中 可 以 形 成 共 价 键 的 基 团 主 要 有 ： 氨 基 、 羧 基 、 巯 基 、 羟 基 、 酚 基和 咪 唑 基 等 。 要 使 载 体 与 酶 形 成 共 价 键 ， 必 须 首 先 使 载 体 活 化 ， 第 一 个 离 子 结 合 法 固 定 化 酶 ：DEAE-Cellulose固

15、 定 化 过 氧 化 氢 酶第 一 个 工 业 化 的 固 定 化 酶 ：DEAE-Sephadex A-50固 定 化 氨 基 酰 化 酶 4、 交 联 法借 助 双 功 能 试 剂 使 酶 分 子 之 间 发 生 交 联 作 用 ， 制 成 网 状 结 构 的 固定 化 酶 的 方 法 。戊 二 醛 有 两 个 醛 基 ， 这 两 个 醛 基 都 可 与 酶 或 蛋 白 质 的 游 离 氨 基 反应 ， 形 成 席 夫 （ Schiff） 碱 ， 而 使 酶 或 菌 体 蛋 白 交 联 ， 制 成 固 定化 酶 或 固 定 化 菌 体 。交 联 法 制 备 的 固 定 化 酶 或 固 定

16、化 菌 体 结 合 牢 固 ， 可 以 长 时 间 使 用 。 但 由 于 交 联 反 应 条 件 较 激 烈 ， 酶 分 子 的 多 个 基 团 被 交 联 ， 致 使 酶活 力 损 失 较 大 ， 而 且 制 备 成 的 固 定 化 酶 或 固 定 化 菌 体 的 颗 粒 较 小 ，给 使 用 带 来 不 便 。 为 此 ， 可 将 交 联 法 与 吸 附 法 或 包 埋 法 联 合 使 用 ，以 取 长 补 短 。 常 用 的 双 功 能 试 剂 有 戊 二 醛 、己 二 胺 、 顺 丁 烯 二 酸 酐 、 双 偶氮 苯 等 。 其 中 应 用 最 广 泛 的 是戊 二 醛 。 酶 分

17、子 之 间 共 价 交 联 和 与 水 不 溶 性 载 体 共 价 偶 联 酶 分 子 ； （ a） 酶 分 子 之 间 用 双 功 能 基 团 的 化 学 交 联 试 剂 相 互 交 联 成 水 不 溶 性的 固 定 化 酶 ； （ b） 酶 分 子 被 偶 联 到 水 不 溶 性 载 体 上 形 成 水 不 溶 性 的 固 定 化 酶 本 章目 录 5.4 固 定 化 酶 的 特 性 ：l 将 酶 或 含 酶 菌 体 固 定 化 制 成 固 定 化 酶 或 固 定 化 菌 体 以 后 ， 由 于 受 到载 体 等 的 影 响 ， 酶 的 特 性 可 能 会 有 些 变 化 。 l 固 定

18、化 酶 的 稳 定 性 一 般 比 游 离 酶 的 稳 定 性 好 。 l 固 定 化 酶 的 最 适 作 用 温 度 一 般 与 游 离 酶 差 不 多 ， 活 化 能 也 变 化 不 大 。 l 酶 经 过 固 定 化 后 ， 其 作 用 的 最 适 pH值 往 往 会 发 生 一 些 变 化 。 这 一 点在 使 用 固 定 化 酶 时 ， 必 须 引 起 注 意 。 影 响 固 定 化 酶 最 适 pH值 的 因 素主 要 有 两 个 ， 一 个 是 载 体 的 带 电 性 质 ， 另 一 个 是 酶 催 化 反 应 产 物 的性 质 。l 固 定 化 酶 的 底 物 特 异 性 与

19、游 离 酶 比 较 可 能 有 些 不 同 ， 其 变 化 与 底 物分 子 量 的 大 小 有 一 定 关 系 。 固 定 化 酶 底 物 特 异 性 的 改 变 ， 是 由 于 载体 的 空 间 位 阻 作 用 引 起 的 。 本 章目 录 乙 酰 -DL Ala L Ala +乙 酸乙 酰 -D AlaAminoacylase 氨 基 酰 化 酶5.5 固 定 化 酶 的 应 用世 界 上 第 一 种 工 业 化 生 产 的 固 定 化 酶 。 1969年 ， 日 本 田 边 制 药 公司 将 从 米 曲 霉 中 提 取 分 离 得 到 的 氨 基 酰 化 酶 ， 用 DEAE-葡 聚

20、糖 凝胶 为 载 体 通 过 离 子 键 结 合 法 制 成 固 定 化 酶 ， 将 L-乙 酰 氨 基 酸 水 解生 成 L-氨 基 酸 ， 用 来 拆 分 DL-乙 酰 氨 基 酸 ， 连 续 生 产 L-氨 基 酸 。剩 余 的 D-乙 酰 氨 基 酸 经 过 消 旋 化 ， 生 成 DL-乙 酰 氨 基 酸 ， 再 进 行拆 分 。 生 产 成 本 仅 为 用 游 离 酶 生 产 成 本 的 60 左 右 。 泵储罐 反 应 产 物 离 心 机 消旋反应器固 定 化 酶柱 子 晶 体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala 高 果 糖 浆 的 生 产淀粉 液

21、化液淀粉酶糖化酶糖化液 喷雾干燥氢化还原结晶异构酶 粉状葡萄糖山梨醇结晶葡萄糖果葡糖浆 果糖42%葡萄糖55% 低聚糖分离 混合 高果糖浆果糖浆果糖80-90% 果糖55%葡萄糖39%低聚糖世 界 上 生 产 规 模 最 大 的 一 种 固 定 化酶 。 将 培 养 好 的 含 葡 萄 糖 异 构 酶 的放 线 菌 细 胞 用 60 65 热 处 理15min， 该 酶 就 固 定 在 菌 体 上 ， 制成 固 定 化 酶 ， 催 化 葡 萄 糖 异 构 化 生成 果 糖 ， 用 于 连 续 生 产 果 葡 糖 浆 。 青 霉 素 酰 化 酶 转 化 流 程 图 酶 传 感 器l 酶 传 感

22、器 是 由 固 定 化 酶 与 传 感 元 件 两 部 分 组 成 的 ， 其 中 酶 是 与 适 当的 载 体 结 合 形 成 的 不 溶 于 水 的 固 定 化 酶 膜 。l 最 常 用 的 酶 传 感 器 是 酶 电 极 ， 即 将 固 定 化 酶 膜 与 转 换 电 极 做 在 一 起 ，当 酶 膜 与 被 测 物 发 生 催 化 反 应 而 生 成 电 极 活 性 物 质 后 ， 电 极 测 定 活性 物 质 并 将 其 转 换 为 电 信 号 输 出 。 酶 电 极l 酶 电 极 是 由 固 定 化 酶 与 各 种 电 极 密 切 结 合 的 传 感 装 置 。1962年 Clar

23、k和 Lyons提 出 模 型 ， 1967年 Updike和 Hicks首先 制 造 出 酶 电 极 并 把 它 用 于 葡 萄 糖 的 定 量 分 析 。l 酶 电 极 一 般 可 根 据 电 极 检 测 物 理 量 的 不 同 分 为 电 流 型 和 电压 型 ， 前 者 一 般 有 氧 电 极 、 H2O2电 极 等 ， 后 者 有 NH3、 CO2、H2电 极 等 。l 较 典 型 的 一 种 酶 电 极 为 葡 萄 糖 酶 电 极 。 葡 萄 糖 醌 H2O 葡 萄 糖 酸 氢 醌葡 萄 糖 氧 化 酶氢 醌 醌 2H 2ePt铂 电 极 葡 萄 糖 酶 电 极 结 构 示 意 图

24、 l葡 萄 糖 酶 电 极 的 敏 感 膜 是 葡 萄 糖 氧 化酶 （ G O D） ， 它 被 固 定 在 聚 乙 烯 酰 胺 凝胶 上 。 在 酶 膜 的 作 用 下 葡 萄 糖 发 生 氧 化反 应 ， 消 耗 掉 氧 而 生 成 葡 萄 糖 酸 和 过 氧化 氢 。 通 过 用 电 极 测 量 被 消 耗 的 氧 或 生成 的 过 氧 化 氢 就 可 了 解 葡 萄 糖 浓 度 。 手 掌 型 葡 萄 糖 (glucose)分 析 仪 脲 电 极Urea + 2H2O 2NH4+2HCO3-脲 酶产 生 的 2NH4+为 阳 离 子 电 极 感 应 。此 外 还 有 ： 氨 基 酸

25、电 极醇 电 极尿 酸 电 极乳 酸 电 极青 霉 素 电 极亚 硝 酸 离 子 电 极 ： 菠 菜 亚 硝 酸 还 原 酶 产 生 NH 3 一 些 常 见 的 酶 电 极底 物 酶 电 极5 腺 苷 酸 5 腺 苷 酸 脱 氨 酶 NH4+乙 醇 ， 醇 乙 醇 脱 氢 酶 Pt过 氧 化 物 过 氧 化 氢 酶 Pt (O2)磷 酸 葡 萄 硫 酸 酯 酶 +葡 萄 糖 氧 化 酶 Pt (O2)D-氨 基 酸 D 氨 基 酸 氧 化 酶 NH 4+L-氨 基 酸 L 氨 基 酸 氧 化 酶 NH3蔗 糖 蔗 糖 酶 +葡 萄 糖 氧 化 酶 Pt (H2O2)琥 珀 酸 琥 珀 酸 脱 氢 酶 Pt (O2)硫 酸 酯 芳 基 硫 酸 酯 酶 Pt硫 氰 酸 硫 氰 酸 酶 CN硝 酸 盐 硝 酸 盐 还 原 酶 / 亚 硝 酸 盐 还 原 酶 NH4+亚 硝 酸 盐 亚 硝 酸 盐 还 原 酶 NH 3（ 气 体 ）草 酸 草 酸 脱 羧 酶 CO2（ 气 体 ）青 霉 素 青 霉 素 酶 pH乳 酸 乳 酸 脱 氢 酶 ； 细 胞 色 素 b Pt， Fe（ CN） -4L 氨 基 酸 脱 羧 酶 CO2L 精 氨 酸 精 氨 酸 酶 NH4+L 天 冬 酰 胺 天 冬 酰 胺 酶 NH4+ 本 章目 录