《酶活力测定方法》PPT课件

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1、2 酶 活 力 测 定 法 1） 基 本 原 理 ： 酶 活 力 是 指 酶 催 化 一 定 化 学 反 应 的 能 力 。酶 活 力 测 定 实 质 上 是 测 定 一 个 被 酶 所 催 化 的 化学 反 应 速 度 。 酶 反 应 速 度 越 快 所 表 示 的 酶 活 力越 高 。 酶 反 应 速 度 可 以 用 单 位 时 间 反 应 底物 的 减 少 或 产 物 的 增 加 来 表 示 。 通 常 酶 活 力 测 定 时 ， 先 制 备 酶 反 应进 程 曲 线 和 酶 浓 度 曲 线 。 通 过 酶 反 应 速度 的 测 定 ， 求 得 酶 的 浓 度 或 含 量 。 酶 反 应

2、 进 程 曲 线 纵 坐 标 为 底 物 或 产 物 的 变 化量 ， 横 坐 标 为 反 应 时 间 ， 曲 线 斜 率 表 示 反 应 速度 。 从 酶 反 应 进 程 曲 线 求 得 反 应 的 初 速 度 。酶 浓 度 曲 线 纵 坐 标 为 反 应 速 度 ， 横 坐 标 为 酶量 。 通 过 酶 浓 度 曲 线 检 验 反 应 测 定 系 统 是 否 适宜 。 酶 活 力 测 定 的 要 求 ： 测 得 的 反 应 速 度必 须 和 酶 浓 度 有 线 性 的 比 例 关 系 ， 这也 是 检 验 酶 反 应 和 测 定 系 统 是 否 适 宜 、正 确 的 标 准 。 2） 酶

3、促 反 应 的 条 件 及 影 响 因 素 底 物 的 浓 度 ： 一 般 选 用 底 物 的 浓 度 S=100Km。 pH： 选 用 一 个 适 宜 的 缓 冲 离 子 和 离 子 强 度 、 适 宜 的 pH值 的 缓 冲 系 统 来 控 制 pH。 温 度 ： 酶 反 应 的 温 度 通 常 选 用 25 、 30 或 37 ， 实 验 中 温 度 变 动 应 控 制 在 0.1 以 内 。 辅 助 因 子 ： 有 些 酶 需 要 金 属 离 子 ， 有 些 需 要 相 应 的 辅 酶 。 空 白 和 对 照 试 验 ： 空 白 试 验 ： 是 指 杂 质 反 应 和 自 发 反 应

4、引起 的 变 化 量 ， 它 提 供 的 是 未 知 因 素 的 影 响 。空 白 值 可 以 通 过 不 加 酶 ， 或 不 加 底 物 ， 或 二者 都 加 （ 酶 预 先 经 过 失 效 处 理 ） 。 对 照 试 验 ： 是 指 用 纯 酶 或 标 准 酶 制 剂 测得 的 结 果 ， 主 要 作 为 比 较 或 标 定 的 标 准 。 3） 测 定 方 法 ： 取 样 测 定 法 ： 酶 反 应 不 同 的 时 间 取 样 终 止 反 应 测 定 酶 变 性 剂 ： 5% 三 氯 醋 酸 3% 高 氯 酸 其 它 酸 、 碱 、 醇 类 加 热 ： 使 酶 失 效 连 续 测 定 法

5、 ： 在 反 应 过 程 中 对 反 应 系 统 进行 直 接 连 续 检 测 。检 测 方 法 ：紫 外 -可 见 分 光 光 度 法 旋 光 法荧 光 分 光 光 度 法 电 化 学 测 定 法 酶 偶 联 测 定 法 离 子 选 择 性 电 极 测 定 法 等 。 示 例 ： 胰 蛋 白 酶 效 价 测 定胰 蛋 白 酶 肽 键 、 酰 氨 键 、 酯 键 （ 碱 性 氨 基 酸 ）水 解 速 率 ： 酯 键 酰 氨 键 肽 键供 试 品 溶 液 ： 50 60单 位 /ml底 物 溶 液 ： N-苯 甲 酰 -L-精 氨 酸 乙 酯 浓 度 ： A： 0.575 .0585N-苯 甲

6、酰 -L-精 氨 酸 乙 酯 N-苯 甲 酰 -L-精 氨 酸 253nm处 的 A随 酶 促 反 应 递 增 ， 根据 酶 活 力 单 位 定 义 计 算 酶 活 力 。H 2N-C-NH CH 2CH 2CH 2-CH -COOC2H 5NH NH -CO- 酶 活 性 单 位 ： 在 最 适 的 条 件 下 ， 每 分 钟 能转 化 一 个 微 摩 尔 底 物 的 酶 量 定 为 一 个 活 性单 位 。测 定 ：空 白 ： 底 物 溶 液 + 0.001mol/L HCl 每 30s A的 改 变 ： 0.015 0.018，呈 线 性 关 系 的 时 间 不 得 少 于 3min。供

7、 试 品 溶 液 + 底 物 溶 液 计 时摇 匀 25.0。C+ 0.5。C测 定 ： 每 隔 30 s，读 取 A， 共 5 min A每 分 钟 改 变 0.003， 相 当 于 1个 胰 蛋白 酶 单 位 。 供 试 液 的 A每 分 钟 改 变 A1 - A2 T 相 当 于 的 单 位 数 为每 mg供 试 品 中 含 胰 蛋 白 酶 单 位 数 为 0.003 :1 A1 - A2T=: X A1 - A20.003T A1 - A20.003TW P = A1A20.003 T W 重 组 人 白 细 胞 介 素 11的 胰 蛋 白 酶 切 肽图 分 析 肽 图 分 析 是 评

8、 价 重 组 产 品 蛋 白 质 结 构及 其 生 产 工 艺 稳 定 性 的 重 要 方 法 ,目 前 常 用的 方 法 有 裂 解 - 微量 肽 图 法 和 胰 蛋 白 酶 切 肽 图法 。 1。 酶 切 条 件 取 浓 度 为 3 -1的 样 品 0 4 对 1% 4 3充 分 透 析 ,然 后 取 透 析 样 品 250 至微 量 进 样 瓶 ,加 0 3 -1 处 理 的 胰蛋 白 酶 10 混 匀 ,于 37 温 控 自 动 进 样 器 酶 切 ,每 80 进 样 一 针 ,进 样 量 6 ,用 32色 谱 软 件 选 择 214 进 行 分 析 ,直 至 11完 全 酶 解 。

9、按 此 方 法 摸 索 最 佳酶 切 时 间 ,在 第 14针 后 11已 被 完 全 酶 切 ,酶 切 时 间 在 18 22 范 围 内 肽 图 图 谱 基 本 一 致 ,即 确 定 最 佳 酶 切 条 件 为 37 保 温 20 。 2。 系 统 测 试 系 统 测 试 标 准 物 质 进 样 后 呈 3个峰 ,12次 重 复 进 样 3个 峰 保 留 时 间 的 分 别为 0. 4%,0 .6%和 0. 8%,峰 面 积 的 分 别 为0 .7%,0 .8%和 0 .8%。 11对 照 品 37酶 切 20 后 于 4 温 控 自 动 进 样 器 连 续 进 样 5次 ,结 果 见 图

10、 1。 5个 色 谱 图 完 全 重 叠 在 一 起 ,所 产 生21个 峰 的 保 留 时 间 、 峰 高 和 峰 面 积 的 均分 别 小 于 1 .0%,5 .4%和 9. 8%,表 明 本 系 统 误 差小 ,重 复 性 好 ,可 用 于 11的 肽 图 分 析 。 3批 11制 品 的 图 谱完 全 一 致 ,说 明 该 厂 11的 生 产 工 艺 是稳 定 的 ;与 公 司 生 产 的 11对 照 品比 较 有 20个 峰 与 对 照 品 一 致 ,但 第 6 峰 的 峰 高 和峰 面 积 均 明 显 较 小 ,且 在 第 9和 第 10 峰 之 间 多 一个 峰 ,说 明 该 厂 11蛋 白 质 结 构 与 公 司 生 产 的 11比 较 存 在 细 小 差 别 。 返 回 练 习 与 思 考1 何 谓 ： 生 化 药 物 、 生 物 技 术 药 物 、基 因 工 程 药 物 和 生 物 制 品 ？2 生 化 药 物 和 基 因 工 程 药 物 各 分 哪几 种 ？3 与 化 学 合 成 药 物 的 分 析 相 比 ， 生物 药 物 的 分 析 有 何 特 点 ？ 返 回