《蛋白质的研究方法》PPT课件

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1、1 高 级 生 物 化 学 暨 南 大 学 医 学 院 生 物 化 学 系 宇 丽 2011、 11 2 蛋 白 质 的 研 究 方 法 第 一 节 蛋 白 质 对 象 的 选 择 和 样 品 的 获 取 3 一 、 研 究 对 象 的 选 择无 论 何 种 来 源 的 生 物 材 料 一 般 都 含 有 成 千 上 万 种 不 同的 蛋 白 质 分 子 ；在 一 种 生 物 组 织 中 ， 同 时 又 存 在 着 多 种 蛋 白 质 组 分 。虽 然 它 们 都 具 有 肽 链 结 构 ， 但 在 分 子 大 小 、 极 性 以及 电 荷 上 会 有 所 差 异 。 4 选 择 研 究 蛋

2、白 质 的 原 则 ： 在 组 织 中 含 量 比 较 高 相 对 比 较 稳 定 的 蛋 白 质 （ 如 血 液 中 的 Hb； 肌 肉 中 的 肌 球 蛋 白 和 肌 动 蛋 白 等 ）从 模 式 生 物 基 因 组 测 序 结 果 来 看 ， 每 一 种 生 物 有 机 体内 都 还 有 大 量 的 蛋 白 质 （ 50 左 右 ） 从 来 没 有 被 研 究过 。 5 获 取 蛋 白 质 样 品 的 方 法 ： u直 接 从 生 物 组 织 中 提 纯 蛋 白 质 为 主u根 据 基 因 组 测 序 获 得 的 信 息 （ 1） 可 以 获 得 所 要 研 究 的 特 定 蛋 白 质

3、的 AA序 列 。 （ 先 根 据 推 出 的 AA序 列 合 成 对 象 蛋 白 中 的 一 段 肽 ， 用 它 去 获 得 有 关 的 抗 体 ，然 后 用 抗 体 去 探 测 蛋 白 质 的 存 在 ， 甚 至 可 以 用 抗 体 通 过 亲 和 层 析 纯 化 对 象蛋 白 ） （ 2） 去 获 得 有 关 基 因 的 cDNA全 序 列 ， 然 后 通 过 重 组 DNA技 术 去 表 达 重 组 蛋 白 。 有 偏 差 ， 甚 至 完 全 是 假 象 。 即 使 推 测 得 到 的 蛋 白 质 编 码 信 息 是 对 的 ， 在 细 胞 内 还 存 在 转 录 后 的 RNA加 工

4、 ， 翻 译 后 的 蛋 白 质 的 修 饰 和 加 工 等 基 因 序 列 上 目 前 还 无 法 反 映 的 信 息 。 6 直 接 从 生 物 组 织 中 提 纯 蛋 白 质 应 用 各 种 分 辨 效 果 好 的 化 学 及 物 理 化 学 方 法蛋 白 质 的 分 离 纯 化 包 括 以 下 过 程 ：1. 破 碎 生 物 组 织 ， 并 用 适 当 的 缓 冲 液 将 蛋 白 质 抽 提 出 来 ； 2.将 有 关 的 蛋 白 质 分 级 沉 淀 下 来 ; （ 盐 析 法 或 有 机 溶 剂 法 ）3.应 用 层 析 法 或 电 泳 法 使 它 们 各 自 分 开 ； 4.蛋 白

5、 质 结 晶 ；5.蛋 白 质 纯 度 鉴 定 和 含 量 测 定 。 7 制 备 过 程 中 注 意 事 项 ： 要 求 自 始 至 终 保 持 在 天 然 状 态1. 避 免 一 切 过 激 因 素 如 ： 过 酸 或 过 碱 ， 高 温 ， 重 金 属 等 的 影 响 。2. 通 常 都 在 低 温 条 件 下 操 作 。3. 尽 可 能 使 样 品 中 蛋 白 质 的 浓 度 维 持 在 较 高 水 平 。 8 二 、 细 胞 的 破 碎 少 数 蛋 白 质 -存 在 于 细 胞 外 面 的 （ 如 血 液 和 体 液 中 等 ） ， 大 多 数 蛋 白 质 -都 存 在 于 细 胞

6、的 里 面 。 一 般 固 形 生 物 材 料 首 先 都 必 须 加 以 破 碎 ， 以 释 放 出 细 胞 内 的 蛋 白 质 组 分 。 生 物 材 料 必 须 新 鲜 1. 材 料 -80 2. 或 者 制 成 干 粉 （ 丙 酮 ） 3. 低 温 存 放 破 碎 的 方 法 ：1. 机 械 破 碎 法 ： 利 用 机 械 力 的 搅 切 作 用 ， 使 细 胞 研 碎 高 速 搅 切 器 、 玻 璃 匀 浆 器 、 家 用 搅 肉 器 、 研 钵 、 玻 璃 珠 高 速 匀 浆 器 以 及 静 压 器 （ 高 压 破 碎 ） 。2.渗 透 破 碎 法 ： 利 用 低 渗 条 件 ，

7、使 细 胞 溶 胀 破 碎 。 红 血 球 放 于 水 中 ， 便 发 生 自 溶 。 3.交 替 冻 融 法 ： 生 物 组 织 经 冻 结 后 ， 细 胞 内 液 结 冰 膨 胀 ， 而 使 细 胞 胀 破 。4.超 声 波 法 ： 利 用 超 声 波 震 荡 ， 使 细 胞 膜 上 所 受 张 力 不 均 而 解 体 。5.酶 消 化 法 ： 利 用 蛋 白 酶 、 溶 菌 酶 、 蜗 牛 复 合 酶 等 对 细 胞 膜 或 细 胞 壁 的 分 解 作 用 ， 使 它 们 解 体 10 *抽 提 作 用 ： 生 物 材 料 在 破 碎 的 过 程 中 ， 通 常 被 浸 在适 当 的 缓

8、 冲 液 中 ， 使 细 胞 中 的 蛋 白 质 等 内 容物 释 放 到 这 种 溶 液 中 去 。 膜 蛋 白 的 处 理 ： 复 杂 细 胞 膜 的 结 构 12 按 其 所 在 位 置 大 体 可 分 为 ：两 种 类 型 外 周 蛋 白 （ 通 过 次 级 键 和 外 膜 脂 质 的 极 性 头 螯 合 在 一 起 ） 固 有 蛋 白 （ 嵌 合 在 膜 双 层 中 ， 它 通 过 疏 水 作 用 与 膜 内 部 脂 质 层 的 疏 水 性 尾 部 相 结 合 具 有 螺 旋 结 构 ）外 周 蛋 白 -选 择 适 当 离 子 强 度 及 PH的 含 有 EDTA的 缓 冲 液 抽

9、提 （ 高 盐 溶 液 ）固 有 蛋 白 -？ ？ ？ 13 *增 溶 作 用 ： 抽 提 固 有 蛋 白 质 时 ， 既 要 削 弱 它 与膜 脂 的 疏 水 性 结 合 ， 又 要 使 它 仍 保 持 疏水 基 暴 露 在 外 的 天 然 状 态 ， 这 一 过 程 通常 称 为 增 溶 作 用 。 14 常 用 的 增 溶 试 剂 有 ： 有 机 溶 剂 -易 使 蛋 白 质 变 性离 液 性 离 子 -CN-、 CIO4-及 I-等 虽 能 削 弱 疏 水 作 用 ， 也 易 使 蛋 白 质 变 性 。磷 酸 酯 酶 -水 解 去 磷 酯 ， 只 适 用 于 那 些 仅 仅 部 分 插

10、 入 双 层 的 膜 蛋 白 . 去 污 剂 -同 时 包 含 有 疏 水 和 亲 水 部 分 . 按 其 结 构 特 征 :阴 （ 阳 ） 离 子 去 污 剂 两 性 离 子 去 污 剂 非 离 子 型 去 污 剂 等 。 去 污 剂 ：一 类 具 有 亲 水 性 头 部 疏 性 尾 巴 的 双 亲 性 （ amphipathic） 脂 类 分 子作 用 ： 既 可 以 破 坏 细 胞 的 磷 脂 双 层 结 构 ， 又 可 以 与 具 有疏 水 性 表 面 的 膜 蛋 白 结 合 ， 从 而 阻 止 释 放 出 来 的 膜 蛋白 通 过 疏 水 相 互 作 用 形 成 大 的 、 可 沉

11、淀 的 聚 集 体 。 16 临 界 微 团 浓 度 （ critical micelle concentration， CMC)： 每 一 种 去 污 剂 都 具 有 一 特 征 性 的 CMC。 CMC值 与 其 分 子 中 疏 水 部 分 与 亲 水 部 分 的 结 构 有 关 。 当 去 污 剂 低 于 此 值 的 时 候 ， 去 污 剂 分 子 在 水 溶 液中 将 不 形 成 微 团 ， 达 到 此 值 的 时 候 ， 微 团 开 始 形 成 。 17 有 的 去 污 剂 的 亲 水 性 头 部 可 离 子 化 （ 即 含 有 一 带 电 基 团 ）如 ： 脱 氧 胆 酸 钠 （

12、sodium deoxycholate） 和 十 二 烷 基 硫 酸 钠 （ sodium dodecylsulfate， SDS） 等 ；有 的 去 污 剂 不 能 解 离 ， 所 以 分 子 中 缺 少 带 电 基 团 ， 如 ： Triton X-100， 辛 基 葡 萄 糖 苷 ( octylglucoside） 等 。 18 离 子 化 去 污 剂 （ SDS） ：作 用 ： 其 “ 疏 水 尾 巴 ” 破 坏 蛋 白 质 分 子 的 疏 水 性 部 分 的 结 构 ， 其 带 电 的 “ 头 部 ” 破 坏 蛋 白 质 分 子 中 的 氢 键 和 离 子 键 。作 用 的 结 果

13、是 ： 使 任 何 蛋 白 （ 不 管 是 膜 蛋 白 还 是 水 溶 性 蛋 白 ） 都 ， 并 溶 液 中 ， 同 时 。在 部 分 情 况 下 ， 当 去 污 剂 被 透 析 掉 后 ， 蛋 白 质 可 以 复 性并 恢 复 生 物 活 性 。 19 SDS-聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ SDS-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE） ：就 是 利 用 SDS的 这 种 结 合 在 整 个 蛋 白 分 子 上 ， 并 使 蛋 白完 全 变 性 的 特 性 。这 样 经 过 SDS变 性 的 蛋 白 质 在 电 场 中 完 全

14、按 大 小 分 离 开 。 20 非 离 子 去 污 剂 ：相 对 温 和 ， 一 般 不 会 使 蛋 白 质 变 性 。 只 是 将 蛋 白 质分 子 从 膜 上 溶 解 下 来 而 已 。当 去 污 剂 其 CMC值 的 时 候 ， 去 污 剂 分 子 与 膜 蛋白 表 面 的 疏 水 区 域 结 合 ， 使 蛋 白 质 在 水 溶 液 中 溶 解而 不 聚 集 。当 去 污 剂 其 CMC值 的 时 候 ， 去 污 剂 分 子 将 与 膜磷 脂 一 起 形 成 混 合 微 团 ， 膜 蛋 白 以 整 合 在 微 团 中 的形 式 存 在 。一 般 选 择 非 离 子 去 污 剂 来 保

15、持 膜 蛋 白 生 物 活 性 22 23 稳 定 剂 ：防 止 蛋 白 质 分 子 可 能 被 同 时 释 放 的 蛋 白 质 水 解 酶 降 解 、Pr空 间 结 构 可 能 被 温 度 或 化 学 试 剂 等 环 境 因 素 破 坏 而丧 失 生 物 学 活 性 等 。处 理 ： 需 要 在 缓 冲 液 中 加 入 蛋 白 酶 抑 制 剂 ； 在 低 温 下 操 作 ； 加 入 稳 定 剂 (如 甘 油 等 ） 24 细 胞 碎 片 的 去 除 离 心 ( centrifugation) 原 理 ： 悬 浮 在 溶 液 中 的 两 个 或 多 个 不 同 质 量 或 密 度的 颗 粒 （

16、 如 细 胞 、 细 胞 器 、 大 分 子 复 合 体 、 或 分 子等 ） 沉 降 到 试 管 的 底 部 的 速 度 是 不 一 样 的 ， 质量 越 大 、 或 密 度 越 高 沉 降 的 速 度 越 快 。沉 淀 ： 固 体 性 的 细 胞 碎 片 和 细 胞 器 沉 降 到 离 心 管 的 底 部 形 成 ；上 清 ： 绝 大 多 数 蛋 白 分 子 或 蛋 白 复 合 体 保 留 在 细 胞 抽 提 液 中 即 上 清 中 25 三 、 目 标 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 -蛋 白 质 的 分 级 沉 淀 和 层 析 分 离将 不 同 蛋 白 质 分 开 的 性 质 主

17、要 包 括 ： 分 子 量 的 大 小 带 电 情 况 水 溶 性 与 某 种 物 质 的 特 异 高 亲 和 力 等 26 （ 一 ） 蛋 白 质 的 分 级 沉 淀 常 用 的 方 法 有 盐 析 法 和 有 机 溶 剂 法 。 蛋 白 质 颗 粒 表 面 有 一 层 水 膜 ， 也 称 水 化 层 。 水 化 层的 存 在 使 蛋 白 质 颗 粒 相 互 隔 开 ， 不 会 聚 集 成 大 颗 粒而 沉 淀 。蛋 白 质 有 两 性 解 离 性 质 。 如 果 溶 液 的 PH值 偏 离 了 PI，所 有 分 子 都 带 相 同 电 荷 ， 又 会 进 一 步 增 进 它 们 的 分散

18、能 力 。 27# 28 等 电 点 （ PI） ：1.能 破 坏 蛋 白 质 分 子 水 化 作 用2.是 减 弱 分 子 间 同 性 相 斥 作 用 的 因 子 PI能 降 低 蛋 白 质 在 水 中 的 溶 解 度 ， 使 Pr 29 盐 析 法 概 念 ： 蛋 白 质 在 不 同 浓 度 的 中 性 盐 溶 液 中 溶 解 度 有 不 同 程 度 的 降 低 ， 采 用 添 加 中 性 盐 的 方 法 使 各 种 蛋 白 质 依 次 分 别 沉 淀 出 来 的 方 法 。 优 点 ： 操 作 简 便 对 易 变 性 的 蛋 白 质 有 一 定 的 保 护 作 用 ， 适 用 范 围 十

19、 分 广 泛 。 缺 点 ： 分 辨 能 力 差 ， 纯 化 倍 数 低 30 1 盐 析 基 本 原 理在 蛋 白 质 水 溶 液 中 添 加 无 机 盐 ， 可 以 产 生 两 种影 响 ： (1)盐 离 子 与 Pr分 子 中 的 极 性 基 团 离 子 基 团 作 用 降 低 Pr分 子 的 活 度 系 数 ， 趋 使 其 溶 解 度 。(2)盐 离 子 也 与 水 这 种 偶 极 分 子 作 用 ， 使 水 分 子 的 活 度 降 低 ， 导 致 Pr水 合 程 度 的 减 少 ， 从 而 趋 使 Pr溶 解 度 。 31 *盐 溶 （ salting in)-当 溶 液 中 的 盐

20、 离 子 强 度 比 较低 的 时 候 ， 蛋 白 质 的 溶 解 度 会 随 着 盐 浓 度 的 增 加 而增 加 ， 这 种 现 象 叫 做 .*盐 析 （ salting out )-但 当 溶 液 中 的 盐 离 子 强 度比 较 高 的 时 候 ， 蛋 白 质 的 溶 解 度 会 随 着 盐 浓 度 的 增加 而 降 低 ， 这 种 现 象 叫 做 .一 定 的 盐 浓 度 下 ， 每 一 种 蛋 白 都 有 一 不 同 的 特 异 溶解 度 。 32 2 影 响 盐 析 作 用 的 因 素（ 1） 盐 的 种 类（ 2） PH和 温 度 #（ 3） 蛋 白 质 浓 度 % 33 （

21、 1） 盐 的 种 类对 同 一 种 Pr而 言 ， 价 数 愈 高 的 盐 离 子 ， 盐 析 能 力也 愈 强 : PO3-4 SO42- C2O42- （ CHOHCOO-） 2 AC CL NO3- Br - I- CNS- K+ Rb+ Na+ Cs+ Li+ NH4+ 负 离 子 价 数 较 高 的 中 性 盐 （ 如 硫 酸 盐 、 磷 酸 盐 等 ）的 Ks值 常 较 一 价 中 性 盐 的 Ks值 高 。 Ks:盐 析 常 数 （ 价 数 较 高 时 ， Ks 值 也 较 大 ） 。 代 表 盐 析 的 效 率 ， 是 与 Pr及 盐 种 类 有 关 的 特 性 常 数 。

22、34 硫 酸 铵 （ 常 用 盐 析 剂 ） 优 点 ： 盐 析 能 力 较 强 具 有 较 高 的 溶 解 度 较 低 的 溶 解 度 温 度 系 数 价 格 低 廉 不 产 生 副 作 用 。 缺 点 ： 缓 冲 能 力 较 差 PH难 控 制 # 35 （ 2） PH和 温 度S。 代 表 蛋 白 质 在 无 机 盐 溶 液 中 的 溶 解 度 除 取 决 于 Pr的 种 类 ， 还 受 PH及 温 度 影 响 : PH=PI时 ， S。 的 数 值 极 小 S。 随 温 度 增 加 而 减 低 。盐 析 过 程 中 ， 若 增 高 温 度 ， 有 助 于 Pr的 析 出 。 # 36

23、（ 3） 蛋 白 质 浓 度 Pr较 高 ， 在 较 低 无 机 盐 浓 度 时 ,蛋 白 质 便 开 始 析 出 ， 盐 析 界 限 比 较 宽 。 Pr较 低 ， 需 要 无 机 盐 的 浓 度 也 高 ， 即 盐 析 界 限 变 窄 。 解 决 办 法 ： 对 于 高 浓 度 的 蛋 白 质 可 以 应 用 稀 释 作 用 来 调 节 盐 析 浓 度 界 限 ， 有 利 于 混 合 物 的 分 离 。 37 蛋 白 质 浓 度 愈 高 ， 所 需 盐 的 饱 和 度 极 限 愈 低 。 但 蛋 白 质 浓 度 愈 高 时 ， 其 他 蛋 白 质 的 共 沉 淀 作 用 也 愈 强 所 以

24、 当 蛋 白 质 溶 液 太 浓 时 ， 应 适 当 稀 释 ， 通 常 在 2.5 3.0 之 间 比 较 合 适 。 38 1.基 本 原 理 一（ 1） 在 PI附 近 ， Pr主 要 以 偶 极 离 子 形 式 存 在 。 此 时 若 添 加 有 机 溶 剂 ， 由 于 有 机 溶 剂 有 较 低 的 介 电 常 数 ， 可 使 溶 液 介 电 常 数 减 小 ， 增 强 了 偶 极 离 子 间 静 电 引 力 ， 从 而 使 分 子 集 合 而 沉 淀 出 来 。（ 2） 有 机 溶 剂 本 身 的 水 合 作 用 会 破 坏 Pr表 面 的 水 合 层 ， 也 促 使 Pr变 得

25、不 稳 定 而 聚 集 析 出 . Q1 Q2库 仑 定 律 ： F = 2 F： 2个 带 电 质 点 之 间 的 相 互 作 用 力 ： 2个 带 电 质 点 之 间 的 距 离 ： 介 电 常 数有 机 溶 剂 法 分 辨 力 比 盐 析 方 法 高 ， 提 纯 效 果 好 39 溶 剂 介 电 常 数 乙 醚 4.33 丙 酮 21.4 乙 醇 21 甲 醇 33 水 -80 甘 氨 酸 溶 液 137 （ 2.5M） 在 低 的 环 境 中 ， Pr上 基 团 间 的 作 用 力 会 受到 影 响 , 超 过 限 度 时 ， 使 蛋 白 质 变 性 。 40 解 决 办 法 ：1.有

26、 机 溶 剂 沉 淀 一 般 都 须 控 制 在 低 温 条 件 下 进 行 。2.添 加 甘 AA， 调 节 溶 液 中 的 介 电 常 数 不 致 过 低 ， 创 造 合 适 的 分 离 条 件 。 另 ： 蛋 白 质 本 身 是 多 价 离 子 ， 对 溶 液 介 电 常 数 有 相 当 贡 献 。 (当 蛋 白 质 浓 度 太 低 时 ， 如 添 加 有 机 溶 剂 过 度 会 产 生 变 性 现 象 ， 这 时 加 入 甘 AA等 物 质 ， 可 以 避 免 蛋 白 质 变 性 )。 41 2. 影 响 有 机 溶 剂 沉 淀 Pr的 因 素 （ 1） PH值 PH=PI时 蛋 白

27、质 的 溶 解 度 最 低 。 按 PI来 调 节 PH值 ， 有 利 于 分 离 。 （ 2） 蛋 白 质 浓 度 Pr越 高 ， 加 入 一 定 量 有 机 溶 剂 后 ， Pr析 出 越 多 。 此 时 溶 液 的 也 相 应 提 高 ， 可 以 减 少 Pr的 变 性 。 Pr越 高 ,Pr分 子 间 作 用 引 起 的 共 沉 淀 现 象 也 显 著 增 强 ， 这 样 分 离 效 果 差 ， 不 利 于 分 级 沉 淀 。 只 有 选 择 恰 当 的 Pr才 有 可 能 获 得 良 好 的 分 高 效 果 。 42 （ 3） 离 子 强 度 中 性 盐 的 加 入 能 促 使 Pr

28、在 有 机 溶 剂 中 溶 解 ， 并 且 能 防 止 Pr的 变 性 。 但 含 盐 过 多 ， 却 会 使 Pr 过 度 析 出 ， 不 利 于 分 级 沉 淀 。 一 般 0.05M的 稀 盐 溶 液 。（ 4） 多 价 阳 离 子 Pr与 多 价 的 阳 离 子 如 （ Zn2+、 Cu2+等 ） 能 结 合 成 复 合 物 。 这 种 复 合 物 在 有 机 溶 剂 中 往 往 使 Pr 溶 解 度 变 小 。 43 (二 ） 蛋 白 质 的 层 析 分 离 法 （ 色 谱 法 ）最 基 本 的 特 征 ： 固 定 相 流 动 相 44 原 理 各 种 物 质 得 以 分 离 的 最

29、 基 本 原 因 ： 就 在 于 它 们 在 这 两 个 相 之 间 具 有 不 同 的 分 配 系 数 .两 相 作 相 对 运 动 时 ， 这 些 物 质 在 两 相 间 进 行 多 次 的 分 配 ， 即 使 它 们 的 分 配 系 数 只 有 微 小 的 差 异 ， 通 过 这 个 过 程 也 能 得 到 最 大 的 分 离 效 果 。 45 层 析 分 离 能 力 的 实 质 物 质 的 分 配 问 题 *分 配 系 数 ： 当 一 种 溶 质 分 布 在 两 个 互 不 相 溶 的 溶 剂 中 时 ， 它 在 固定 相 和 移 动 相 两 相 内 的 浓 度 之 比 是 一 个 常

30、 数 ， 这 称 为 分配 系 数 。 C1 K = C2 *质 量 分 配 系 数 ：若 不 用 浓 度 而 用 物 质 的 绝 对 量 的 比 值 来 表 示 ， 则 称 为 质量 分 配 系 数 即 ： Vs D= K Vm Vs : 固 定 相 的 体 积 Vm : 流 动 相 的 体 积 46 层 析 种 类 ： 气 相 层 析 按 两 相 状 态 来 分 液 相 层 析 吸 附 层 析 分 配 层 析 按 层 析 机 理 来 分 离 子 交 换 层 析 凝 胶 排 阻 层 析 亲 和 层 析 柱 层 析 按 操 作 方 式 来 分 薄 层 层 析 纸 层 析层 析 法 分 离 、

31、纯 化 ： Pr、 多 肽 和 AA 47 离 子 交 换 层 析 法*原 理 ： 阴 （ 阳 ） 离 子 交 换 树 脂 颗 粒 （ 作 为 固 定 相 ） 填 充 在 层 析 柱 内 ， 由 于 阴 （ 阳 ） 离 子 交 换 树 脂 颗 粒 上 带 正 （ 负 ） 电 荷 ， 能 吸 引 溶 液 中 的 阴 （ 阳 ） 离 子 。 然 后 再 用 含 阴 （ 阳 ） 离 子 的 溶 液 洗 柱 。 含 负 电 量 小 的 蛋 白 质 首 先 被 洗 脱 下 来 ， 增 加 阴 离 子 浓 度 ， 含 负 电 量 多 的 蛋 白 质 也 被 洗 脱 下 来 ， 于 是 两 种 蛋 白 质

32、被 分 开 。 48固 定 相 ：1.纤 维 素 - DEAE纤 维 素 、 CM纤 维 素2.葡 聚 糖 49 u纤 维 素 : 骨 架 为 柔 性 长 链1.加 入 量 -加 入 层 析 柱 的 蛋 白 质 量 通 常 纤 维 素 量 的 十 分 之 一 。2.提 高 分 辨 率 ， 样 品 体 积 应 尽 可 能 地 少 。3.在 洗 脱 时 ， 可 以 通 过 改 变 洗 脱 缓 冲 液 的 PH， 而 使 蛋 白 质 分 子 电 荷 减 少 而 被 解 吸 下 来 ， 也 可 以 通 过 提 高 洗 脱 缓 冲 液 中 离 子 强 度 ， 减 弱 蛋 白 质 分 子 与 载 体 亲

33、和 力 的 办 法 ， 将 蛋 白 质 组 分 逐 一 洗 脱 下 来 。 50 u葡 聚 糖 的 离 子 交 换 树 脂 :骨 架 为 三 维 网 状 结 构 优 点 ：1. 同 时 具 有 分 子 筛 的 作 用2. 因 其 高 度 的 网 状 结 构 ， 所 带 有 的 交 换 基 团 也 比 纤 维 素 多 得 多 。 交 换 容 量 为 离 子 交 换 纤 维 素 的 3 5倍 。 缺 点 ： 它 的 床 体 积 常 受 PH或 盐 浓 度 影 响 而 变 化 ， 对 分 离效 果 有 一 定 程 度 的 干 扰 。 51 凝 胶 排 阻 层 析又 称 分 子 筛 或 凝 胶 过 滤

34、 （ gel filtration）原 理 ：载 体 为 有 一 定 孔 径 的 多 孔 性 亲 水 性 凝 胶 。当 分 子 大 小 不 同 的 混 合 物 通 过 这 种 凝 胶柱 时 ， 直 径 大 于 孔 径 的 分 子 将 不 能 进 入凝 胶 内 部 ， 便 直 接 沿 胶 粒 间 隙 流 出（ 全 排 出 ） 。 较 小 的 分 子 进 入 能 容 纳 它的 孔 穴 ， 绕 道 而 行 ， 在 柱 内 保 留 时 间 就比 较 长 。 这 样 ， 较 大 的 分 子 被 先 洗 脱 下来 ， 而 较 小 的 分 子 后 被 洗 脱 下 来 ， 从 而达 到 相 互 分 离 的 目

35、 的 . 52 53 常 用 过 滤 层 析 凝 胶 的 截 留 分 子 量 范 围 54 用 作 凝 胶 的 载 体 物 质 有 三 类 ： u 交 联 葡 聚 糖 凝 胶 商 品 名 为 Sephadex Gu 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 商 品 名 为 Bio-gel P (丙 烯 酰 胺 + N， N -次 甲 基 二 丙 烯 酰 胺 聚 合 而 成 P值 表 示 不 同 的 交 联 度 )u 琼 脂 糖 凝 胶 商 品 名 为 Sepharose或 Bio-gel A （ 从 海 藻 琼 脂 中 分 离 除 去 琼 脂 胶 后 的 中 性 级 成 分 是 D-半 乳 糖 和 3,6-

36、脱 水 -L-半 乳 糖 相 间 重 复 结 合 而 成 的 链 状 化 合 物 ） 55 琼 脂 糖 凝 胶 优 点 ：1.其 机 械 强 度 比 葡 聚 糖 凝 胶 和 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 好 得 多 。2.对 蛋 白 质 等 高 分 子 的 吸 附 作 用 也 小 得 多3.适 用 分 子 量 的 范 围 宽 ， 最 大 可 以 到 108。 56 凝 胶 排 阻 层 析 的 应 用 ：1.作 为 分 析 工 具 (分 子 量 差 别 大 的 物 质 ) 2.作 为 脱 盐 工 具 (Sephadex G-25)3.高 分 子 溶 液 的 浓 缩 (不 稳 定 的 高 分 子 )

37、4.去 除 热 原 物 质 (DEAE-A-25)5.物 质 的 分 离 提 纯6.用 于 测 定 高 分 子 物 质 的 分 子 量 57 吸 附 层 析 法原 理 ： 柱 层 析 中 ， 含 有 Pr分 子 的 混 合 物 随 流 动 相 通 过 由 吸 附 剂 组 成 的 固 定 相 时 ， Pr分 子 通 过 各 种 次 级 作 用 能 够 吸 附 在 吸 附 剂 上 ,由 于 不 同 分 子 的 吸 附 能 力 不 同 ， 可 以 通 过 洗 脱 使 它 们 逐 一 解 脱 出 来 ， 而 使 混 合 物 得 以 分 离 。优 点 ：1.物 理 吸 附 ， 吸 附 能 量 比 较 低

38、 ， 洗 脱 也 比 较 容 易 。2.操 作 简 便 ， 吸 附 剂 容 易 获 得 ， 价 格 较 低 廉 58 固 定 相 ：吸 附 剂 磷 酸 钙 凝 胶磷 酸 钙 胶 Ca3（ PO4） 2磷 酸 氢 钙 胶 CaHPO42H2O羟 基 磷 酸 钙 胶 Ca5（ PO4） 3OH 羟 基 磷 灰 石 磷 酸 钙 胶 对 蛋 白 质 的 吸 附 作 用 原 理 :主 要 是 由 于 . Ca2+与 Pr负 电 荷 性 基 团 结 合 。 . 磷 酸 基 团 与 Pr正 电 荷 基 团 59 流 动 相 ： 洗 脱 剂 -柠 檬 酸 盐作 用 ： 柠 檬 酸 离 子 因 与 Ca2+有

39、更 强 的 相 互 作 用 ， 它 能 大 大 降 低 蛋 白 质 和 凝 胶 的 吸 附 能 力 。 NaCl， KCI甚 至 浓 度 高 达 3M时 ， 也 不 影 响 Pr负 电 荷的 吸 附 ， 相 反 这 些 盐 可 以 大 大 降 低 Pr正 电 荷 的 吸 附 。 因此 在 高 浓 度 的 这 些 盐 溶 液 中 应 用 羟 基 磷 灰 石 进 行 层 析 时 ，可 以 专 门 吸 附 酸 性 蛋 白 质 及 中 性 蛋 白 质 而 排 除 碱 性 蛋 白质 。 60 亲 和 层 析 法1.原 理 ： 利 用 生 物 高 分 子 具 有 能 和 某 些 相 对 应 的 专 一 分

40、 子 可 逆 结 合 的 特 性 。 如 ， 酶 的 活 性 部 位 能 和 底 物 抑 制 剂 辅 助 因 子 专 一 性 地 结 合 ,改 变 条 件 又 能 使 这 种 结 合 解 除 . 酶 的 变 构 中 心 与 变 构 因 子 （ 或 称 效 应 物 ） 之 间 、 抗 体 与 抗 原 之 间 、 激 素 与 受 体 之 间 ， 结 合 蛋 白 与 结 合 物 之 间 。 这 些 被 作 用 的 对 象 物 质 称 之 为 配 基 （ ligand) 。 61 固 定 相 -配 基 固 定 在 固 相 载 体 上 62 63 2.优 点 ： 具 有 高 度 的 吸 附 专 一 性

41、层 析 过 程 简 便 、 快 速3.载 体 的 选 择 ：(1)必 须 具 有 高 度 亲 水 性 ， 使 Pr分 子 容 易 与 它 接 近 .(2)非 专 一 性 吸 附 要 十 分 小 。(3)必 须 具 有 大 量 可 供 活 化 而 能 与 配 基 结 合 的 基 团 。 常 用 载 体 ： 纤 维 素 、 葡 聚 糖 凝 胶 、 琼 脂 糖 凝 胶 、 聚 丙 烯 酸 胺 凝 胶 和 多 孔 玻 璃 等 。 64 高 效 液 相 层 析 法 （ HPLC） 液 相 层 析 :凡 是 以 液 体 作 为 流 动 相 的 层 析 法 。高 效 液 相 层 析 法 : 高 压 输 液

42、的 情 况 下 ,数 分 钟 甚 至 1min就 可以 完 成 一 次 理 想 的 分 离 ,这 种 方 法 为 HPLC.条 件 : 1.柱 长 50-100cm, 柱 径 2-3mm; 2.固 定 相 载 体 颗 粒 的 直 径 通 常 10-15um; 3.高 压 输 液 泵 加 压 ， 一 般 压 力 在 20-200Kg/cm2 4.保 持 1ml/min的 流 速 65 固 定 相 :聚 苯 乙 烯 凝 胶 多 孔 性 二 氧 化 硅 微 球 多 孔 玻 璃 珠 等 流 动 相 : (1） 与 固 定 相 不 互 溶 或 溶 解 很 少 ; （ 2） 避 免 与 固 定 相 发 生

43、 不 可 逆 反 应 ； （ 3） 对 样 品 要 有 适 当 的 溶 解 度 ； （ 4） 与 采 用 的 检 测 器 相 适 应 。 66 67 68 HPLC分 析 图 谱 0 5 1 0 1 5 2 0OD380 nm 0 .00 00 .00 50 .01 0 0 5 1 0 1 5 2 00 .00 00 .00 50 .01 0 0 .01 50 .02 0 R eten tion tim e (m in)0 5 1 0 1 5 2 0OD380 nm 0 .00 00 .00 50 .01 00 .01 5 0 5 1 0 1 5 2 0 0 .00 00 .00 50 .01

44、 00 .01 5 0 .02 00 .02 5A B C D D N P -O PP rod uct Product Product Product D N P -O P D N P -O P D N P -O P R eten tion tim e (m in)0 5 1 0 1 5 2 00 .00 0 0 .00 50 .01 0 R eten tion tim e (m in)0 5 1 0 1 5 2 00 .00 00 .00 5 0 .01 00 .01 5 Product D N P -O P Product D N P -O PM 8-PE F A : C A su spe

45、nsion (contro l)B : C M T -3 (1 0g/m l)C : P h enan thro lin e (5 m M )D : E D T A (5 m M )E : E xtract fro m C AF : M M P -8 (10 0g/m l 70 分 类 ：(1)液 一 液 分 配 层 析 ： 利 用 溶 质 在 流 动 相 中 分 配 系 数 的 差 别 而 达 到 分 离 目 的 ， 是 应 用 最 多 的 方 法 之 一 。(2)液 一 固 吸 附 层 析 :利 用 溶 质 在 固 体 吸 附 剂 上 吸 附 能 力 的 差 别 而 达 到 分 离 目 的

46、 。(3)离 子 交 换 层 析 ： 通 过 溶 质 和 固 体 （ 树 脂 ） 的 离 子 交 换 作 用 ， 利 用 不 同 溶 质 离 子 交 换 能 力 的 差 别 而 达 到 分 离 目 的 。(4)凝 胶 渗 透 层 析 ： 按 溶 质 分 子 量 大 小 而 分 离 ， 也 即 分 子 筛 层 析 。 71 第 二 节蛋 白 质 的 检 测 和 鉴 定 72 一 般 可 通 过 以 下 几 个 方 面 进 行 ： 光 谱 学 特 性 电 泳 行 为 特 异 抗 体 反 应 特 异 生 物 学 活 性 N一 末 端 氨 基 酸 序 列 测 定 质 谱 检 测 排 阻 层 析 73

47、一 、 光 谱 学 特 性 蛋 白 质 光 谱 特 性 的 总 原 则 是 ：当 一 定 波 长 的 光 （ 即 电 磁 波 ） 与 Pr分 子 接 触时 ， 所 吸 收 的 或 反 射 的 辐 射 能 量 与 Pr分 子 结构 特 征 和 浓 度 是 密 切 相 关 的 。 圆 二 色 谱 、 磁 共 振 技 术 、 X一 射 线 晶 体 衍 射 法 、 红 外光 谱 、 拉 曼 光 谱 技 术 等 光 谱 学 技 术 等 。 74 不 同 波 长 范 围 的 电 磁 波 与 其 作 用 后 的 剩 余 能 量 值 反映 的 是 蛋 白 质 分 子 的 不 同 特 征 :190 -200nm

48、波 长 范 围 的 光 吸 收 反 映 的 是 蛋 白 质 主 链上 的 酞 胺 键 中 电 子 的 被 激 发 ；230 - 300nm波 长 范 围 的 光 吸 收 谱 （ 最 大 吸 收 值 在280nm波 长 处 ） 反 映 的 是 蛋 白 质 分 子 中 芳 香 族 氨 基 酸侧 链 上 电 子 的 被 激 发 。所 以 一 般 情 况 下 ， 溶 液 在 280nm波 长 处 （ 属 紫 外光 范 围 ） 的 光 吸 收 能 力 被 当 做 是 存 在 蛋 白 质 的 证 据 。 75 二 、 电 泳 检 测 蛋 白 质 分 子 为 两 性 电 解 质 ， 在 不 同 PH的 溶

49、液 中 带有 不 同 的 电 荷 ， 从 而 在 直 流 电 场 中 能 够 泳 动 ， 这 就 是电 泳 现 象 。按 介 质 状 态 来 分 :自 由 电 泳 区 带 电 泳按 操 作 原 理 可 分 为 : 一 般 电 泳 等 电 电 泳 等 电 聚 焦 电 泳 免 疫 电 泳 等 76 自 由 电 泳 -以 溶 液 为 介 质 ， 在 溶 液 中 将 蛋 白 质 分 离 缺 点 :自 由 电 泳 过 程 中 扩 散 严 重 ， 分 辨 率 有 限区 带 电 泳 -在 固 体 支 持 物 上 所 进 行 的 电 泳 固 体 支 持 物 有 :滤 纸 、 醋 酸 纤 维 薄 膜 、 琼 脂

50、 糖 凝 胶 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 优 点 :分 辨 率 很 高 。 77 SDS-聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ SDS-PAGE) SDS (十 二 烷 基 硫 酸 钠 )是 阴 离 子 型 去 污 剂(Sodium dodecyl sulfate, SDS) Q u = （ 迁 移 率 ） 6 r u 与 Q、 r有 关 若 蛋 白 质 分 子 带 有 足 够 的 电 荷 ， 在 SDS-PAGE中 进行 电 泳 ， 由 于 分 子 筛 效 应 ， u 仅 取 决 于 分 子 的 大 小 。因 此 SDS一 凝 胶 电 泳 可 以 按 蛋 白 质 分 子 大 小 的 不 同

51、 将 其分 开 。 这 时 ， 若 以 分 子 量 的 对 数 （ logM） 对 相 对 于 染 料 前 沿的 迁 移 率 （ Rf） 作 图 ， 呈 现 线 性 关 系 。 78 79 这 种 关 系 ， 对 一 种 胶 浓 度 时 ， 只 适 用 于 一 定 的分 子 量 范 围 ： 5 胶 浓 度 时 ， 适 用 于 分 子 量 6 200万 的 区 间 ； 10 胶 浓 度 时 ， 适 用 于 分 子 量 1.6 7万 的 区 间 ； 15 胶 浓 度 时 ， 适 用 于 分 子 量 1.2 4.5万 的 区 间 。 80 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 图 谱 等 电 聚 焦

52、电 泳 （ isoelectric focusing, IEF） Pr分 子 有 一 定 的 PI， 当 它 处 在 一 个 由 阳 极 阴 极 梯 度 逐 渐 增 加 的 介 质 中 ， 并 通 过 以 直 流 电 时 ， 它 便 “ 聚 焦 ” 在 与 其 PI相 同 的 pH位 置 上 。 PI不 同 的 蛋 白 质 泳 动 后 形 成 位 置 不 同 的 区 带 而 得 到 分 离 。 82 优 点 ：1.有 很 高 的 分 辨 率 ；2.可 以 区 分 等 电 点 只 有 0.01 pH单 位 差 异 的 蛋 白 质 ；3.根 据 其 所 在 位 置 还 能 够 测 定 蛋 白 质

53、的 分 子 量 ；4.对 很 稀 的 样 品 ， 最 后 达 到 高 度 的 浓 缩 。 83 能 形 成 PH 梯 度 的 物 质 必 须 具 有 以 下 特 性 ：（ 1） 有 足 够 的 缓 冲 能 力 ， 样 品 存 在 时 也 能 保 持 稳 定 的 PH梯 度 ；（ 2） 有 足 够 的 电 导 能 力 ， 以 使 一 定 的 电 流 能 够 透 过 ；（ 3） 是 小 分 子 的 物 质 ， 电 泳 后 易 于 除 去 ；（ 4） 化 学 组 成 与 被 分 离 的 蛋 白 质 物 质 不 同 ， 不 干 扰 测 定 ；（ 5） 不 会 使 蛋 白 质 变 性 或 与 其 发 生

54、 副 反 应 84 双 向 电 泳 （ two-dimensional gel electrophoresis） 第 一 向 采 用 聚 丙 烯 酸 胺 凝 胶 等 电 聚 焦 电 泳 -PI第 二 向 采 用 SDS一 凝 胶 电 泳 -分 子 量 由 于 结 合 了 蛋 白 质 的 等 电 点 和 分 子 量 两 种 完 全 不同 的 特 一 性 来 进 行 分 离 ， 因 此 具 有 非 常 高 的 分 辨 率 85 双 向 PAGE 86 双 向 电 泳 技 术 缺 点 ， 具 有 以 下 特 征 的 蛋 白 质 在 二 维电 泳 中 还 很 难 被 检 测 到 ： 等 电 点 （ p

55、l)值 很 大 或 很 小 的 ， 比 如 大 于 8和 小 于 4 的 那 些 蛋 白 质 ； 分 子 质 量 很 大 的 蛋 白 质 ， 比 如 大 于 l00kDa的 蛋 白 质 就 比 实 际 的 少 了 ， 而 大 于 150kDa的 蛋 白 质 就 几 乎 完 全 探 测 不 到 了 （ 尽 管 在 一 维 电 泳 凝 胶 上 这 些 大 蛋 白 质 都 能 清 楚 地 被 观 察 到 ； 疏 水 性 蛋 白 质 。 免 疫 电 泳 将 电 泳 分 离 和 专 一 性 免 疫 沉 淀 相 结 合 的 分 析 方 法 ： 蛋 白 质 样 品 先 在 琼 脂 或 琼 脂 糖 凝 胶 中

56、 电 泳 ， 然 后 在与 泳 动 路 线 相 距 几 毫 米 的 槽 中 放 入 针 对 该 样 品 的 免 疫 血清 。 由 于 双 向 扩 散 的 结 果 ， 形 成 抗 原 一 抗 体 复 合 物 的 免疫 沉 淀 弧 线 由 于 免 疫 反 应 有很 高 的 专 一 性 ，可 用 于 鉴 定 Pr的纯 度 ， 分 析 样 品中 蛋 白 质 的 组 分 。 PH 8.6 88 电泳方向 89 三 、 测 定 纯 化 蛋 白 质 的 分 子 大 小 测 定 蛋 白 处 于 非 变 性 条 件 下 的 大 小 一 般 可 通 过 ：u 排 阻 层 析u 沉 降 平 衡 超 速 离 心 （

57、sedimentation equlibrium ultracentrifugation) u 动 态 光 散 射 （ dynamic light scattering)u 孔 径 梯 度 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ pore gradient polyacrylamide gel electrophoresis） 90 沉 降 平 衡 超 速 离 心（ sedimentation equlibrium ultracentrifugation) 用 该 技 术 测 定 蛋 白 质 分 子 质 量 的 时 候 ， 测 定 的 是 几个 绝 对 动 力 学 参 数层 析 或 电 泳 技

58、 术 ： 需 要 用 标 准 蛋 白 样 品 进 行 校 正 。该 技 术 可 普 遍 地 用 于 测 定 从 小 到 蔗 糖 、 大 到 病 毒 的不 同 样 品 的 大 小 。 用 沉 降 平 衡 超 速 离 心 测 定 蛋 白 质 分 子 质 量 的 总 的 原理 是 ： 当 Pr样 品 在 相 对 较 低 的 离 心 速 度 （ 但 还 是 处 于 超 速 范 围 ）下 离 心 时 ， 在 一 个 从 离 心 管 顶 部 指 向 底 部 的 、 越 往 底 部 越 大的 沉 降 力 作 用 下 ， Pr分 子 很 快 形 成 一 个 从 离 心 管 顶 部 往 下 逐渐 增 加 的 连

59、 续 r浓 度 梯 度 ； 与 此 同 时 ， 将 有 一 个 方 向 与 离 心 力 相 反 的 扩 散 力 作 用 于Pr上 ； 当 沉 降 离 心 进 行 一 定 时 间 之 后 ， 作 用 于 Pr上 的 离 心 力 和扩 散 力 （ 前 者 与 蛋 白 在 离 心 管 中 所 在 位 置 离 轴 心 的 距 离 成 正比 例 ， 后 者 与 Pr浓 度 成 正 比 ） 正 好 相 互 消 除 ， 这 样 使 得 蛋 白样 品 的 表 面 处 于 一 个 平 衡 状 态 而 不 再 移 动 ； 在 这 种 平 衡 条 件 下 ， 不 同 部 位 Pr浓 度 与 所 在 部 位 离 轴

60、心 的 距 离 之 间 的 关 系 与 蛋 白 质 分 子 质 量 成 某 种 数 学 关 系 。 92 密 度 梯 度 离 心 93 动 态 弹 性 光 散 射是 通 过 测 定 蛋 白 颗 粒 的 直 径 、 然 后 与 标 准 蛋 白 样 品比 较 而 推 算 蛋 白 分 子 质 量 的 方 法 。这 种 测 定 技 术 也 可 通 过 观 察 样 品 是 单 分 散 性 的（ monodispersed） 还 是 多 分 散 性 的 （ polydisper-sed） 而 反 映 所 测 蛋 白 样 品 是 否 均 一 。 94 孔 径 梯 度 电 泳 通 过 制 备 具 有 一 定

61、范 围 的 从 大 到 小 孔 径 梯 度 的 聚丙 烯 酸 胺 凝 胶 ， 然 后 让 蛋 白 在 非 变 性 条 件 下 在 这 种凝 胶 上 电 泳 而 进 行 的 。经 过 低 电 流 条 件 下 的 较 长 时 间 的 电 泳 ， 蛋 白 质 分 子将 在 凝 胶 中 与 其 直 径 相 等 的 孔 径 处 停 下 （ 因 为 再 往下 凝 胶 中 的 孔 径 比 蛋 白 直 径 小 ） 。 通 过 与 同 时 在 胶中 电 泳 的 标 准 样 品 比 较 我 们 就 可 以 知 道 蛋 白 在 这 种非 变 性 条 件 下 的 分 子 质 量 。 优 点 ： .所 获 得 的 是

62、天 然 状 态 下 的 蛋 白 分 子 大 小 。 2. 如 果 蛋 白 分 子 能 够 在 这 种 低 电 流 电 场 中 长 时 间 保 持 稳 定 的 话 ， 这 种 方 法 比 较 经 济 。 95 质 谱 质 谱 是 一 种 在 化 学 中 被 广 泛 采 用 的 、 测定 原 子 或 分 子 质 量 方 法 中 最 直 接 、 最 准 确 的方 法 。 96 用 质 谱 测 定 蛋 白 质 分 子 质 量 的 总 的 原 理 ： 首 先 纯 化 好 的 蛋 白 样 品 要 被 转 变 成 挥 发 和 带 电 （ 即 解 离 ）状 态 ， 电 离 后 的 蛋 白 质 分 子 （ 带

63、有 多 个 电 荷 ） 然 后 进 入 一 个 真空 加 速 电 场 中 ， 之 后 ， 不 同 质 荷 比 （ m/z） 的 蛋 白 分 子 表 现 出 的 行 为 或者 在 外 加 磁 场 中 的 偏 转 、 或 者 抵 达 固 定 探 测 器 的 所 谓 “ 飞 行时 间 （ time of flight, TOF) 不 一 样 。 利 用 所 测 得 的 质 荷 比 以 及 蛋 白 所 带 的 电 荷 值 ， 计 算 机 软件 很 快 就 会 正 确 地 给 出 所 测 蛋 白 分 子 的 质 量 。 97 用 质 谱 测 定 蛋 白 质 的 分 子 质 量 ， 精 确 一 般 可 达

64、0.01%， 是 目 前 进 行 蛋 白 质 分 子 量 测 定 最 准 确 的 方 法（ 其 准 确 度 超 过 SDS-PAGE、 弹 性 光 散 射 和 孔 径 梯 度 聚丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 ， 甚 至 分 析 超 速 离 心 等 ） 。质 谱 技 术 现 在 也 可 直 接 用 于 ： 氨 基 酸 序 列 的 测 定 蛋 白 质 的 翻 译 后 修 饰 的 鉴 定 蛋 白 质 组 学 研 究 工 作 。 98 四 、 测 定 蛋 白 质 的 氨 基 酸 序 列蛋 白 质 被 纯 化 出 来 ， 需 要 进 一 步 获 取 其 基 因 序 列 ，最 好 测 定 其 部 分 的

65、 或 全 部 的 氨 基 酸 序 列 。 自 动 氨 基 酸 测 序 仪 99 五 、 用 抗 体 探 测 特 异 蛋 白 质 分 子抗 体 是 当 外 源 入 侵 物 （ 包 括 蛋 白 质 ） 与 脊 椎 动 物 体内 的 免 疫 系 统 接 触 后 产 生 的 、 能 与 入 侵 物 特 异 结 合的 防 御 性 蛋 白 质 分 子 。这 种 高 度 特 异 、 高 度 灵 敏 的 抗 体 一 抗 原 结 合 反 应 现在 被 广 泛 地 应 用 于 检 测 微 量 蛋 白 的 存 在 情 况 。 100 目 前 应 用 抗 体 研 究 蛋 白 质 的 方 法 主 要 包 括 下面 几

66、种 ： .蛋 白 质 印 迹 2. 免 疫 共 沉 淀 101 (一 ） 蛋 白 质 印 迹 （ Western blotting）是 一 种 使 用 广 泛 的 检 测 蛋 白 质 的 方 法 。这 种 方 法 与 研 究 核 酸 时 用 的 印 迹 法 原 理 非 常 类 似 蛋 白 质 印 迹 法 是 利 用 抗 原 一 抗 体 之 间 的 特 异 结 合 反 应 而 检 测 的 ；核 酸 类 的 印 迹 法 是 利 用 核 酸 分 子 之 间 通 过 特 异 碱 基 配 对 法 则 而 形 成 杂 交 分 子 这 一 原 理 而 检 测 的 102 蛋 白 质 印 迹 检 测 时 ， 蛋 白 质 混 合 物 （ 一 般 是 细 胞 抽 提 物 ） 通 过电 泳 被 分 开 ， 蛋 白 质 被 （ 一 般 通 过 电 场 的 作 用 ） 转移 到 一 种 特 别 的 膜 （ 如 硝 化 纤 维 膜 等 ） 上 ， 然 后 让特 异 的 抗 体 与 固 定 在 膜 上 的 特 异 抗 原 蛋 白 结 合抗 原 一 抗 体 之 间 结 合 的 高 度 特 异 性 使 得 用 某 种