生化大实验实验聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳

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1、纯 度 检 测 ：1.SDS-PAGE测 定 LDL纯 度2.双 向 免 疫 扩 散 测 定 LDL纯 度含 量 测 定 ：1.Folin-酚 试 剂 法 测 定 LDL含 量 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析LDL纯度 一 、 目 的 要 求1.学 习 电 泳 原 理 和 技 术2.学 习 和 掌 握 SDS 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 垂 直 板 电泳 （ SDS-PAGE） 分 离 蛋 白 质 技 术 电 泳 概 述 ： 电 泳 ： 带 电 荷 的 质 点 ， 在 一 定 条 件 的 电 场 作 用 下 ， 可 向 一 极移 动 ， 如 带 正 电 荷 的 质 点 移 向 负 极 ， 这 种

2、 现 象 称 为 电 泳 。 影 响 电 泳 的 主 要 因 素 ： 1） 电 泳 介 质 的 pH 2） 缓 冲 液 的 离 子 强 度 3） 电 场 强 度 4） 电 渗 作 用 5） 对 支 持 物 的 选 择 6） 温 度 对 电 泳 的 影 响 电 泳 分 类 ： 按 原 理 分 ： 区 带 电 泳 、 移 界 电 泳 、 等 速 电 泳 、 聚 焦 电 泳 二、原 理聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 是 由 单 体 丙 烯 酰 胺 (Acr)和交 联 剂 N,N-甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 (Bis)在 加 速 剂 N，N， N， N四 甲 基 乙 二 胺 (TEMED)和 催 化 剂

3、过硫 酸 铵 (APS)或 核 黄 素 的 作 用 下 聚 合 交 联 成 三维 网 状 结 构 的 凝 胶 ， 以 此 凝 胶 为 支 持 物 的 区 带电 泳 称 为 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 (PAGE)。 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 有 下 列 特 性 ：(1)在 一 定 浓 度 时 ， 凝 胶 透 明 ， 有 弹 性 ， 机 械 性 能 好 ；(2)化 学 性 能 稳 定 ， 与 被 分 离 物 不 起 化 学 反 应 ， 在 很 多 溶 剂 中不 溶 ；(3)对 pH和 温 度 变 化 较 稳 定 ；(4)几 乎 无 吸 附 和 电 渗 作 用 ， 只 要 Acr纯 度

4、高 ， 操 作 条 件 一 致 ，则 样 品 分 离 重 复 性 好 ；(5)样 品 不 易 扩 散 ， 且 用 量 少 ， 其 灵 敏 度 可 达 10-6g(6)凝 胶 孔 径 可 调 节 ， 根 据 被 分 离 物 的 分 子 量 选 择 合 适 的 浓 度 ，通 过 改 变 单 体 及 交 联 剂 的 浓 度 调 节 凝 胶 的 孔 径 ；(7)分 辨 率 高 ， 尤 其 在 不 连 续 凝 胶 电 泳 中 ， 集 浓 缩 、 分 子 筛 和电 荷 效 应 为 一 体 。 因 而 较 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 、 琼 脂 糖 电 泳 等 有 更 高 的 分 辨 率 。 凝 胶 浓

5、 度 (T)的 选 择 与 被 分 离 物 质 分 子 量 密 切 相 关 。 表 3.4 分 子 量 范 围 与 凝 胶 浓 度 的 关 系 分 子 量 范 围 适 用 的 凝 胶 浓 度 /(%) 蛋 白 质 104 20-30 1-4 104 15-20 1-5 104-1 105 10-15 1 105 5-10 5 10 5 2-5 核 酸 (RNA) 104 15 20 104 105 5-10 105-2 106 2-2.6 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 分 为 连 续 系 统 与 不 连 续 系 统 两大 类 。 目 前 常 用 的 多 为 圆 盘 电 泳 (如 图 1)

6、和 板 状 电 泳 (如 图2)， 两 者 电 泳 原 理 完 全 相 同 。 图 1 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 圆 盘 电 泳 示 意 图(A为 正 面 ,B为 剖 面 )(1)样 品 胶 pH6.7 (2)浓 缩 胶 pH6.7 (3)分 离 胶 pH8.9 (4)电 极 缓 冲 液 pH8.3 图 2 夹 心 垂 直 板 电 泳 槽 示 意 图 1.导 线 接 头 2.下 贮 槽 3.凹 形 橡 胶 框 4.样 品 槽 模 板 5.固 定 螺 丝6.上 贮 槽 7.冷 凝 系 统 图 3 凝 胶 模 示 意 图 1.样 品 槽 模 板 2.长 玻 璃 板 3.短 玻 璃 板 4.凹 形

7、橡 胶 框 返 回 不 连 续 体 系 由 电 极 缓 冲 液 、 浓 缩 胶 及 分 离 胶 所 组 成 。浓 缩 胶 是 由 APS催 化 聚 合 而 成 的 大 孔 胶 ， 凝 胶 缓 冲 液为 pH6.7的 Tris-HC1。 分 离 胶 是 由 APS催 化 聚 合 而 成的 小 孔 胶 ， 凝 胶 缓 冲 液 为 pH8.9 Tris-HC1。 电 极 缓冲 液 是 pH8.3 Tris-甘 氨 酸 缓 冲 液 。 2种 孔 径 的 凝 胶 、2种 缓 冲 体 系 、 3种 pH值 使 不 连 续 体 系 形 成 了 凝 胶 孔径 、 pH值 、 缓 冲 液 离 子 成 分 的 不

8、 连 续 性 ， 这 是 样 品浓 缩 的 主 要 因 素 。 不 连 续 凝 胶 分 离 蛋 白 质 原 理 ：（ 1） 样 品 浓 缩 效 应(a)凝 胶 孔 径 不 连 续 性 ：(b)缓 冲 体 系 离 子 成 分 及 pH值 的 不 连 续 性 ； 在 pH6.7的 凝 胶 缓 冲 体 系 中前 导 离 子 或 快 离 子 ： HC1解 离 出 的 氯 根 (C1-) 尾 随 离 子 (trailing ion)或 慢 离 子 ： 甘 氨 酸 根 mclclmppmGG(Cl代 表 氯 根 ， P代 表 蛋 白 质 ， G代 表甘 氨 酸 根 )有 效 迁 移 率 =m， m为 迁

9、移 率 ， 为 解 离 度 ) 当 进 入 pH8.9的 分 离 胶 时 ， 甘 氨 酸 解 离 度 增 加 ， 其 有效 迁 移 率 超 过 蛋 白 质 ；（ c)电 位 梯 度 的 不 连 续 性 ：(2)分 子 筛 效 应(3)电 荷 效 应 图 4 电 泳 过 程 示 意 图A为 电 泳 前 3层 凝 胶 排 列 顺 序 ， 3层 胶 中 均 有 快 离 子 ， 慢 离 子B显 示 电 泳 开 始 后 ， 蛋 白 质 样 品 夹 在 快 、 慢 离 子 之 间 被 浓 缩 成 极 窄 的区 带 。 C显 示 蛋 白 质 样 品 分 离 成 数 个 区 带 。 图 5 不 连 续 系 统

10、 浓 缩 效 应 示 意 图 SDS 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ SDS-PAGE） ：蛋 白 质 在 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 时 ， 它 的 迁移 率 取 决 于 它 所 带 净 电 荷 以 及 分 子 的 大 小和 形 状 等 因 素 。 如 果 在 丙 烯 酰 胺 凝 胶 系 统中 加 入 阴 离 子 去 污 剂 十 二 烷 基 磺 酸 钠 (SDS)，则 蛋 白 质 分 子 的 电 泳 迁 移 率 主 要 取 决 于 它的 分 子 量 ， 而 与 所 带 电 荷 和 形 状 无 关 。 因此 可 以 利 用 SDS-PAGE测 定 蛋 白 质 分 子 量 。 S

11、DS的 作 用 SDS是 一 种 阴 离 子 表 面 活 性 剂 ， 能 使 蛋 白 质的 氢 键 、 疏 水 键 打 开 ， 并 结 合 蛋 白 质 疏 水 部分 ， 形 成 SDS-蛋 白 质 复 合 物 。 在 一 定 条 件 下 ，SDS与 大 多 数 蛋 白 质 的 结 合 比 为 1.4g SDS/1g蛋 白 质 。 由 于 SDS带 有 负 电 荷 ， 使 各种 SDS-蛋 白 质 复 合 物 都 带 上 相 同 密 度 的 负 电荷 ， 它 的 量 大 大 超 过 了 蛋 白 质 分 子 原 有 的 电荷 量 ， 因 而 掩 盖 了 不 同 蛋 白 质 分 子 原 有 的 电荷

12、 和 形 状 的 影 响 ， 电 泳 速 度 只 与 蛋 白 质 的 分子 量 有 关 。 蛋 白 质 染 色 常 用 蛋 白 质 染 色 的 几 种 方 法 ： 1） 氨 基 黑 10B 2） 考 马 斯 亮 蓝 R250 3） 考 马 斯 亮 蓝 G250 4） 固 绿 5） 荧 光 染 料 ： （ l） 丹 磺 酰 氯 （ 2， 5-二 甲 氨 基 萘 磺 酰 氯 ， 简 称 DNS-Cl） ： （ 2） 荧 光 胺 ： （ 3） 2-甲 氧 基 -2， 4-二 苯 基 -3-呋 喃 酮 （ MDPF） ： （ 4） 1-苯 胺 基 -8-萘 磺 酸 （ 简 称 ANS） ： 6） 银

13、染 色 法 常 用 脂 蛋 白 染 色 方 法 ： 1） 油 红 O染 色 2） 苏 丹 黑 B 三 、 试 剂 与 器 材试 剂 ： 10%SDS、 分 离 胶 胶 贮 液 （ 30 ACr-0.8%Bis)、 分 离 胶 缓 冲 液 （ 3.0 mol/L pH8.9Tris HCl 缓 冲 液 ） 、 浓 缩 胶 缓 冲 液（ 0.5 mol/L pH6.7Tris HCl 缓 冲 液 ） 、 10%过 硫 酸 铵 （ APS)、 1%四 基 乙 二 胺 （ TEMED） 及 原液 、 pH8.3Tris-Gly电 极 缓 冲 液 、 0.05 考 马斯 亮 兰 R250染 色 液 、

14、脱 色 液 、 水 饱 和 正 丁 醇 、50%丙 三 醇器 材 ： 稳 压 稳 流 电 泳 仪 、 脱 色 摇 床 、 垂 直 板 电 泳 槽 、电 泳 槽 配 件 （ 玻 板 、 T型 条 、 十 孔 梳 、 棕 色 梳 、加 样 指 示 板 ） 、 烧 杯 、 试 管 、 微 量 移 液 器 、 微 量进 样 器 五、 操作方法1.安 装 夹 心 式 垂 直 板 电 泳 槽 (1)旋 松 固 定 螺 丝 并 打 开 电 泳 槽 ， 仰 放 在 桌 面 上 。(2)在 长 、 短 玻 璃 板 间 加 T型 条 ， 短 玻 璃 板 在 下放 入 硅 橡 框 的 凹 形 槽 中 ， 注 意 勿

15、 用 手 接 触 灌胶 面 的 玻 璃 。(3)将 电 泳 槽 两 侧 固 定 螺 丝 以 对 角 线 的 方 式 旋 紧 。(4)竖 直 电 泳 槽 ， 在 长 短 玻 璃 板 间 加 蒸 馏 水 检 漏 。 2.配 胶 ： SDS-不 连 续 体 系 凝 胶 配 制 20ml分 离 胶 （ 7.5%） 所 需 试 剂 用 量 （ ml） 分 离 胶 胶 贮 液 30 ACr-0.8%Bis 5.00 分 离 胶 缓 冲 液 pH8.9Tris HCl 2.50 10%SDS 0.20 1%TEMED 2.00 双 蒸 水 10.2 10%过 硫 酸 铵 （ APS) 0.10 5%浓 缩

16、胶 所 需 试 剂 用 量 （ ml） 分 离 胶 胶 贮 液 30 ACr-0.8%Bis 0.65 浓 缩 胶 缓 冲 液 pH6.7Tris HCl 1.00 10%SDS 0.08 TEMED原 液 0.005 50%丙 三 醇 2.30 10%过 硫 酸 铵 （ APS) 0.06 3. 制 备 凝 胶 板 将 混 合 后 的 分 离 胶 溶 液 ， 用 细 长 头 的 滴 管 加 至长 、 短 玻 璃 板 间 的 窄 缝 内 ， 加 胶 高 度 依 据 电 泳 槽 标记 ， 约 7ml。 并 在 凝 胶 表 面 沿 短 玻 璃 板 边 缘 轻 轻 加一 层 水 饱 和 正 丁 醇

17、(约 3 4 mm)， 用 于 隔 绝 空 气 ，使 胶 面 平 整 。 约 30-60 min凝 胶 完 全 聚 合 ， 因 聚 合过 程 析 出 水 ， 可 看 到 胶 面 增 加 一 条 界 面 线 。将 凝 胶 表 面 的 蒸 馏 水 倒 去 ， 将 混 合 均 匀 后 的 浓缩 胶 溶 液 ， 用 细 长 头 的 滴 管 加 到 长 、 短 玻 璃 板 的 窄缝 内 (即 分 离 胶 上 方 )， 距 短 玻 璃 上 缘 0.2 cm处 ， 轻轻 加 入 样 品 槽 模 板 即 十 孔 梳 。 静 置 电 泳 槽 ， 10 min左 右 ， 上 胶 即 可 聚 合 ， 再 放 置 1

18、0-20 min， 拔 出 梳子 ， 加 入 电 极 缓 冲 液 ， 使 液 面 没 过 短 玻 璃 板 约 0.5 cm， 即 可 加 样 。 4. 样 品 的 处 理 及 加 样 将 样 品 按 0.5 1 mg/mL加 样 品 溶 解 液 ， 溶 解 后 ，将 其 转 移 到 带 塞 的 小 离 心 管 中 ， 轻 轻 盖 上 盖 子 (不要 塞 紧 ， 以 免 加 热 时 迸 出 )， 在 100 沸 水 浴 中 加 热3min， 取 出 冷 却 后 加 样 。用 微 量 进 样 器 取 25 l上 述 混 合 液 ， 通 过 缓 冲 液 ，小 心 地 将 样 品 加 到 凝 胶 凹

19、形 样 品 槽 底 部 。 5 .电 泳 盖 上 电 泳 槽 盖 子 ， 将 电 泳 仪 的 正 极 与 电 泳 槽 红 色 连线 连 接 ， 负 极 与 黑 色 连 线 连 接 ， 打 开 电 泳 仪 开 关 ， 开 始时 电 流 为 10 mA， 待 样 品 进 入 分 离 胶 后 ， 将 电 流 调 至20-30 mA， 当 溴 酚 蓝 染 料 距 硅 胶 框 1 cm时 ， 停 止 电 泳 ，关 闭 电 源 。6 .染 色 与 脱 色电 泳 结 束 后 ， 取 下 凝 胶 模 ， 卸 下 硅 胶 框 ， 用 棕 色 梳撬 开 短 玻 璃 板 ， 从 凝 胶 板 上 切 下 一 角 作

20、为 加 样 标 记 ， 加入 染 色 液 染 色 1 h， 再 用 脱 色 液 脱 色 过 夜 ， 直 至 蛋 白 质区 带 清 晰 ， 即 可 观 察 蛋 白 质 纯 度 或 计 算 相 对 迁 移 率 。 7. 结 果 观 察 与 处 理 ：量 出 加 样 端 距 电 泳 溴 酚 兰 前 沿 的 距 离 (cm )以 及 各蛋 白 质 样 品 区 带 中 心 与 加 样 端 的 距 离 (cm )， 按 下 式计 算 相 对 迁 移 率 m R:相 对 迁 移 率 mR= 蛋 白 质 样 品 距 加 样 端 迁 移 距 离 (cm )溴 酚 蓝 区 带 中 心 距 加 样 端 距 离 (c

21、m ) 六 、 注 意 事 项（ 1） 安 装 电 泳 槽 时 要 注 意 均 匀 用 力 旋 紧 固 定 螺 丝 （ 对角 旋 紧 ） ， 避 免 缓 冲 液 渗 漏 。（ 2） 上 层 浓 缩 胶 聚 合 快 ， 加 入 10%APS后 快 速 混 匀 ，及 时 转 移 至 玻 板 之 间 ， 并 快 速 插 入 十 孔 梳 ， 以 免 样品 孔 变 形 。 （ 3） 加 样 时 样 品 不 能 超 出 凹 形 样 品 槽 。 加 样 槽 中 不 能有 气 泡 ， 如 有 气 泡 ， 可 用 注 射 器 针 头 挑 除 。 七 、 复 习 题 影 响 电 泳 的 主 要 因 素 有 哪 些 ？ 什 么 是 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 ？ 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 聚 合 时 自 由 基 的 引 发 有 哪 两 种 方法 ？ 不 连 续 凝 胶 电 泳 的 分 离 原 理 。 请 说 出 常 用 蛋 白 质 染 色 的 几 种 方 法 。 请 说 出 常 用 脂 蛋 白 染 色 方 法 。 SDS在 SDS-PAGE中 的 作 用 。 请 叙 述 一 下 血 浆 载 脂 蛋 白 B-100的 分 离 纯 化 过 程 。 蛋 白 质 含 量 测 定 方 法 有 哪 些 ？ 简 述 其 原 理 。 双 向 免 疫 扩 散 测 定 LDL纯 度 原 理 。