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1、小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定【摘 要】目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法。方法以无 血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，在含有10% 成牛血清的DMEM培养液中培养。采用倒置显微镜观察细胞形态，台盼蓝染色 计算存活率，瑞氏染色计算纯度。结果 获得高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞 的形态特征。结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法。【关键词】小鼠；巨噬细胞；分离；培养；鉴定0.引言巨噬细胞是动物机体内重要的免疫细胞，具有抗肿瘤和免疫调节等重要作 用1,2，被广泛应用于体外免疫增强药物的非特异性免疫功能评价3。有很多文献报到已能从多种组织和器官中分离纯化
2、巨噬细胞，但这些方法大多都是 繁琐、复杂，所需时间长且耗资较大。本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象， 探索建立一种巨噬细胞体外分离培养与鉴定简便的方法。1.材料与方法1.1实验对象清洁级巴贝斯小鼠，体重在（30-32g）,由兰州大学实验动物中心提供。1.2实验方法1.2.1小鼠腹腔单核巨噬细胞的分离培养随机选取巴贝斯小鼠，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液5ml。轻 柔小鼠腹部2-3min，静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死，至于解剖板上，无菌 条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5min （1000r/min），弃上清，用 PBS洗涤2遍。再用含10%成牛血清的RPMI-1
3、640培养液（0.1%双抗溶液）调 节至2x106ml-1,接种于培养瓶及6孔板，置37C, 5%CO2培养箱培养2h，弃 上清。用不含小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤2遍，然后加含有10%小牛血 清的RPMI-1640培养液在37CCO2培养箱中继续培养。倒置显微镜观察细胞 形态。1.2.2巨噬细胞的观察与鉴定（1）台盼蓝染色计算存活率。4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml, 用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。（也可买Gibco的成品）； 胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。染色：细胞悬液与0.4% 台盼蓝溶液以9： 1
4、混合混匀。（终浓度0.04%）；计数：在三分钟内，分别计 数活细胞和死细胞。镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色 透明状。（2）瑞氏染色计算细胞纯度。细胞涂片自然干燥后，用蜡笔在两端画线，以防染色时染液外溢。随后将玻 片平置于染色架上，滴加染液3-5滴，使其盖满涂片，大约1分钟后，滴加等量 或稍多的II液，用吸耳球轻轻混匀。冲洗：染色5-10分钟用流水染液，待干。结 果观察，将干燥后的血涂片置显微镜下观察。先用低倍镜观察涂片，再用油镜。2结果2.1小鼠巨噬细胞的分离培养（1）巨噬细胞的观察与鉴定.巨噬细胞体外培养24h观察结果。如图1（2）台盼蓝染色结果。从腹腔分离出来的巨噬细
5、胞进行台盼蓝染色结果显示巨噬细胞的成活 率95%，如图2（3）瑞氏染色结果。从腹腔分离出来的巨噬细胞进行瑞氏染色结果显示巨噬细胞的纯度98%， 如图3图1巨噬细胞体外培养24h观察 图2台盼蓝染色结果图3瑞氏染色结果3.讨论及结论巨噬细胞广泛分布于体内，它不仅参与非特异性免疫，而且是特异性免疫中 一类关键的细胞，参与集体众多的生理和病理反应过程，如巨噬细胞的吞噬和消 除病原微生物5，通过加工处理提成抗原，启动特异性免疫应答6,以及巨噬 细胞通过细胞凋亡清除吞噬的致病病原体等。由于腹腔巨噬细胞多游离存在于腹 腔的腹水中，易于获得，因此许多实验室在进行基础或配合临床研究巨噬细胞功 能及其与疾病的关
6、系、或筛选免疫增强药物和探讨其作用机制时，往往选用小鼠 腹腔巨噬细胞为研究对象。虽然腹腔巨噬细胞的提取方法都是灌胃洗腹腔后，吸出含有巨噬细胞的灌洗 液了，但具体操作略有差异7。预先注入的巨噬细胞刺激剂有淀粉溶液、肉汤、 糖原等，以产生大量的巨噬细胞计入腹腔。虽然这些刺激剂能分离收集到大量的 巨噬细胞，但注入的大分子抗原物质对巨噬细胞吞噬功能有一定的影响，获得的 巨噬细胞已不再是原体内巨噬细胞的基础功能。本实验提取巨噬细胞的方法是对 文献中方法的改进，关键在于活体腹腔注射不含血清的培养液，轻揉腹部后静置 几分钟，然后颈椎脱臼致死小鼠，无菌打开腹腔吸取腹腔液4。此方法相对处 死小数后进行系列操作而
7、言，洗出的灌洗液中混杂的白细胞少，提取局势细胞的 纯度高，是一种简便的小鼠腹腔巨噬细胞的分离方法，为巨噬细胞的相关研究奠 定了基础。【参考文献】徐远义，黄允宁，常越，等.多抗甲素诱导小鼠腹腔巨噬细胞对癌细胞杀 伤增强机制的研究J.免疫学杂志，2006, 22（4）： 396-398.黄琼，李志，杨杏芬，等流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能J. 中国药理学与毒理学杂志，2007，21（2）： 140-146.3 张华，钟英英，方廖琼，等.羊胎盘免疫调节因子对小鼠腹腔巨噬细胞免 疫功能的影响J.中国生化药物杂志，2005，26（2）： 70-72.李海涛，肖丹，等.小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养
8、J.现代生物医学进展 杂志，2008，8（4）： 638-639.5 SO，IH， T-SH，etal.Rearrangement of action cytoskeletion during infection with Escherichia coli O157 in macrophageJ.Cell Struct Funct， 1999， 24 （5）: 237-246.6 Fulton SA， Reba SM， Pai PK，etal.Inhibition of major histocompatibility complex II expression and antigen processing in murine alveolar macrophage by mycobacterium bovis BCG and the 19-kilodalton mycobacterial lipoproteinJ.Infect Immun，2004，72 （4） : 2010-2110.7尹美珍，李世普，等.大鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定J.武汉理工大 学学报，2009，31 （9） : 40-42.
小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定
