第3章仪器分析第四版高效液相色谱

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1、第三章第三章 高效液相色谱法高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography2 第一节、第一节、概述概述一、色谱法的定义一、色谱法的定义色谱法是一种色谱法是一种分离分离方法。方法。它的特点是：有两相，一是固定相，它的特点是：有两相，一是固定相，一是流动相，两相作相向运动。一是流动相，两相作相向运动。将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。色谱分析是一种分离、分析法。色谱分析是一种分离、分析法。3二、色谱法分离原理p当流动相中所携带的混合物流过固定相当流动相中所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发生作用时，就会和固定

2、相发生作用(力的作用力的作用)。由于混合物中各组分在由于混合物中各组分在性质和结构性质和结构上有上有差异，与固定相发生差异，与固定相发生作用的大小作用的大小也有差也有差异。因此在同一推动力作用下，不同组异。因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出而按先后不同的次序从固定相中流出。4三、色谱法的分类p 按流动相状态的不同，可分为按流动相状态的不同，可分为气相色谱法气相色谱法(GC)以气体为流动相的色谱法以气体为流动相的色谱法液相色谱法液相色谱法(LC)以液体为流动相的色谱法以液体为流动相的色谱法超临界流体色

3、谱超临界流体色谱(SFC)5p气相色谱法气相色谱法适合分离分析适合分离分析易汽化（易汽化（在在-190-500范范围内有围内有0.2-10mmHg的蒸气压的）的蒸气压的）稳定、不易分解、稳定、不易分解、不易反应不易反应的样品，特别适合用于的样品，特别适合用于同系物、同分异构体同系物、同分异构体的分离。的分离。p液液相相色色谱谱法法适适合合分分离离分分析析高高沸沸点点、热热不不稳稳定定、离离子子型型的样品。的样品。6p按固定相使用的形式可液相色谱法又可分为：按固定相使用的形式可液相色谱法又可分为：柱色谱（柱色谱（Column Chromatography）将固定相装在色谱柱内将固定相装在色谱柱内

4、纸色谱（纸色谱（Paper Chromatography）用滤纸做固定相或固定相载体的色谱用滤纸做固定相或固定相载体的色谱薄层色谱（薄层色谱（Thin Lay Chromatography）固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上 四、高效液相色谱四、高效液相色谱（一）高效液相色谱（一）高效液相色谱（HPLC）含义：）含义：高效能固体细微粒为固定相高效能固体细微粒为固定相 高压溶剂为流动相高压溶剂为流动相 高灵敏度检测器高灵敏度检测器8p死时间死时间(tM):):完全不保留组分流出系统的时间p保留时间保留时间(tR):):p调整保留时间调整保留时间(tR):):p死体积死体

5、积(VM):):p保留体积保留体积(VR):):p调整保留体积调整保留体积(VR):):（二）高效液相色谱与其它色谱方法的比较（二）高效液相色谱与其它色谱方法的比较1.HPLC与经典与经典LC的比较的比较经典经典LCHPLC固定相颗粒固定相颗粒100m,不均匀不均匀固定相颗粒固定相颗粒BC正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系44R:分离度分离度tR:保留时间保留时间t0：死时间：死时间W：峰底宽度：峰底宽度五五.色谱分离基本方程色谱分离基本方程（一）分离度（一）分离度（R）反映的是相邻两个峰的分开程度反映的是相邻两个峰的分开程度45不同不同R R值时值时峰重叠情

6、峰重叠情况示意图况示意图R1.5可以得到基线分离可以得到基线分离R太小，两个峰无法彻底分离太小，两个峰无法彻底分离R太大，分离时间过长，工作效率低下太大，分离时间过长，工作效率低下一般要求一般要求R1.5，也可遵循行业特殊规定，也可遵循行业特殊规定46其中：其中：n:理论塔板理论塔板 ：分离选择性因子，：分离选择性因子，K:分配系数分配系数 根据该公式优化试验条件，提高分离度根据该公式优化试验条件，提高分离度R。从数学推导来看，分别增大从数学推导来看，分别增大n，k值，都可以提高值，都可以提高分离度。分离度。（二）色谱分离基本方程（二）色谱分离基本方程1、选择因子、选择因子p在定性分析中，通常

7、固定一个色谱峰作为标准在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保）对这个峰的相对保留值，此时可用符号留值，此时可用符号 表示，即表示，即p =tr (i)/tr (s)p 式中式中tr (i)为后出峰的调整保留时间，所以为后出峰的调整保留时间，所以 总总是大于是大于1的。的。p相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。又称选择因子。48分离选择性（分离选择性（）对分离度（）对分离度（R）的影响）的影响 如果如果t0=1min=1.64/1.58=1.04=1.15/0.85

8、=1.35=0.95/0.63=1.50 改变分离选择性改变分离选择性的方法的方法 改用不同的流动相改用不同的流动相 改变流动相的组成改变流动相的组成 并非必须大于并非必须大于1.5！改变流动相改变流动相pH值值 尽量优化前几种实验条件提高尽量优化前几种实验条件提高a值，值，改变柱温改变柱温 避免改变固定相（买新柱子），以便降低成本避免改变固定相（买新柱子），以便降低成本 应用特殊的化学效应应用特殊的化学效应 改变固定相改变固定相 2、分配系数分配系数K 指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即间分配达平衡时的浓度之

9、比值，即 K=溶质在固定相中的浓度溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度=Cs/Cm p分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的，它是每一个溶质的特征值，它仅与三个变量有关：固定相、流动相和温度。与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关503 3、理论塔板数和理论塔板高度的计算方法、理论塔板数和理论塔板高度的计算方法理论塔板数理论塔板数理论塔板高度理论塔板高度HETP=L/n理论塔板数理论塔板数n越大，柱效越高；理论塔高度越大，柱效越高；理论塔高度HETP越小，越小，柱效越高柱效越高51柱效（柱效（n）对分离度（）对分离度（R）的影响）的影响以上两张谱图以上两张谱图

10、k，,值完全相同，仅仅由于柱效高低不同使得它们具有值完全相同，仅仅由于柱效高低不同使得它们具有不同的分离度。不同的分离度。直观的看，峰的尖锐程度代表了柱效高低，峰越尖锐，其柱效越高，通直观的看，峰的尖锐程度代表了柱效高低，峰越尖锐，其柱效越高，通常使用理论塔板数（常使用理论塔板数（n）的大小衡量柱效的高低）的大小衡量柱效的高低524、容量因子（、容量因子（k）对分离度（）对分离度（R）的影响）的影响容量因子越大，分离度越大。容量因子越大，分离度越大。k 1 3 5 7 9 11 13 k/k+1 0.50 0.75 0.83 0.88 0.90 0.92 0.93 1.00但当容量因子大于但当

11、容量因子大于10，k/(k+1)的改变不大，而分析时间将大大延长。的改变不大，而分析时间将大大延长。因此，因此，k的最佳范围是的最佳范围是1k电泳时电泳时,阴离子在负极最后流出阴离子在负极最后流出2 2、毛细管凝胶电泳、毛细管凝胶电泳 CGE 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。分离效率高。蛋白质、蛋白质、DNADNA等采用等采用CGECGE能获得良好分离，能获得良

12、好分离，DNADNA排序排序的重要手段。的重要手段。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。（1 1）缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达）缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。3 3、胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱（MECC，MEKC）在电场力的作用下，在电场力的作用下，胶束在柱中移动。胶束在柱中移动。（2 2）电泳流和电渗流）电泳流和电渗流的方向相反，且的方向相反，且电渗流电渗流 电泳电泳 ，负电胶束以较慢，负电胶束以较慢的速度向负极移动；的速度向

13、负极移动；（5 5）色谱与电泳分离模式的结合。）色谱与电泳分离模式的结合。（3 3）中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，）中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；（4 4）可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电）可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；泳的应用范围；加电渗流改性剂使电渗流反向，用于淌度很大的离子的分离，主要是无机阴离子的分离。负高压。加阳离子表面活性剂，如十六烷基三甲基溴化铵电渗流XXXXX（）（）高压（）（）地4、毛细管离子分析毛细管离子分析三、高效毛细管电泳仪器三、高效毛细管

14、电泳仪器清洗清洗记录记录检检测测器器高高压压电电源源毛细毛细管管电解液电解液1、高压电源：产生、高压电源：产生030kV 稳定连续可调电压稳定连续可调电压2、进样系统进样系统进样量：毛细管长度的进样量：毛细管长度的1%-2%1%-2%；纳升级、非常小；纳升级、非常小；进样端加压、出口端抽真空、虹吸进样进样端加压、出口端抽真空、虹吸进样4、检测系统、检测系统商品仪器：商品仪器：UV-VISUV-VIS；荧光；荧光 实验室：质谱，电分析实验室：质谱，电分析5、清洗系统、清洗系统一般用负压法，一般用负压法，NaOHNaOH洗液，减少吸附洗液，减少吸附3 3、毛细管柱：、毛细管柱：毛细管分离柱不涂敷任何固定液毛细管分离柱不涂敷任何固定液四、应用及前景四、应用及前景 特点特点：A、分离效率高：、分离效率高：104理论塔板数，接近理论塔板数，接近GC空心管，无固定液，空心管，无固定液，H=B/u；流型不同；流型不同B、分离速度快：优于分离速度快：优于LC，接近，接近GCC、进样量少：、进样量少：nL应用：应用：药物分析：旋光异构体药物分析：旋光异构体生化分析：氨基酸衍生物、蛋白、生化分析：氨基酸衍生物、蛋白、DNA弱点：弱点：检测器绝对灵敏度高，但浓度灵敏度仅为检测器绝对灵敏度高，但浓度灵敏度仅为10-6