LeicaSp2共聚焦操作手册

《LeicaSp2共聚焦操作手册》由会员分享，可在线阅读，更多相关《LeicaSp2共聚焦操作手册（9页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、Leica TCS SP2激光共聚焦显微镜系统操作手册、荧光显微镜Leica DMRE的使用A ：步距调节B：电动升台按钮C：电动降台按钮D：微调E：上限设置F：下限设置1、观察、扫描转换拉杆2、卤素灯开关3、透射光探测器开光横档4、荧光光路开关5、荧光滤镜转盘 1： DAPI； 2： TRITC； 3： FITC； 4： SCAN6、镜头侧DIC棱镜转盘7、与镜头相配DIC滤块8、起偏器9、检偏器10、镜头侧DIC棱镜微调旋钮11、光强调节纽12、减光滤光片13、孔径光阑14、视场光阑选择合适的镜头Leica TCS SP2镜头配置镜头类型使用介质放大倍率/数值孔径编号HC PL APO C

2、SDRY10X /0.4506511HC PL APO CSDRY20X/ 0.7506513HC PL APO CSDRY40 X 0.85/ CORR506140HC PL APO Ibd.BCOIL63X /1.4506192Leica TCS SP2 AOBS 镜头配置镜头类型使用介质放大倍率/数值孔径编号HC PL FLUOTARDRY10X/0.3506505HC PL FLUOTARDRY20X/0.5506503HCX PL APOOIL40X/1.25-0.75506176HC PL APO Ibd.BCOIL63X/1.4506192HCX PL APO CSOIL100X

3、/1.40-0.70506038WATER HCX APO L U-V-IWATER63X/0.9506148荧光观察荧光光路开关至“O”位，转轮至“ 1.0X”位，转换拉杆完全推进，荧光滤块换到相应号位（1： DAPI； 2： TRITC； 3： FITC； 4： SCAN）图像输出扫描荧光光路开关至“I”位，转轮至“UV”位，转换拉杆完全拉出，荧光滤块换到4： SCAN）荧光观察（以油镜观察为例）1、样品正面朝上正确放在显微镜样品台上，点上镜油。2、长按电动升台按钮，使镜头和样品上镜油接触，调节微调旋钮，找到样品。3、将光路转换成荧光观察位置，找到预扫描目标，将光路转换至扫描状态。二、Le

4、ica LCS软件的使用（一）、Leica confocal software 界面软件面板介绍左：File View Macro Tools Window Helpnm 400500700800TCS_SP2_RSInstituteUsernameScan ModexyzFormat512 * 512Speed400 Hzlinage Dim. x238.10Image Dim. y238.10jrnlinage Dim. z0.00Voxel-Size465.03 X465.03nmxnAv. Line1Av. Frame1Z.Pos.-0.02ZWide Pos.-22129.80jrn

5、ObjectiveHCX PL APO lbGain PMT 10VGain PMT 20VGain PMT 30VOffset PMT 10%Offset PMT 20%Offset PMT 30%Offset PMT Ti0%Gain PMT Tra0VPinhole AU1.00airyBeginEndZoom1.00Sections1hardware legendTBegin.Series、 EndTCS-menu： accquire view 3D process quantify application右：image windows（二）、设置参数打开软件，默认在Acquire面板

6、中，mode扫描模式为xyz, Format扫描像素为 512x512， average line/frame average 为 1。Mode扫描模式：Format空间扫描模式：xyz xzy 时间扫描模式：xt xyt xzt xyzt 光谱扫描模式：xyA xzKFormat扫描像素一般设置为1024 x1024。average line 一般设为 4 或 8。（三）、软件具体的操作使用单荧光道扫描多荧光扫描DIC图像扫描荧光与DIC图像同时扫描多层扫描时间序列扫描光谱扫描ROI扫描FRETFRAPLIVE MODE多方法组合荧光强度分析单荧光扫描1、按Acquire按钮中的Beam键打

7、开光路设置对话框窗口2、点击Mode选择扫描模式，如平面扫面xyz3、点击Format选择扫描像素，一般用512x512或1024x10244、点击Average line / frame average选择获取图像时平均的次数：4-8次5、双击相应荧光素或染料方法，如FITC、TRITC等6、点击continuous，优化图像质量用快捷钮Z Position调节到最佳层面，点击Q LUT使图像颜色变为伪彩Glow O&U模式 （观察样品荧光强度），用相应PMT调节荧光亮度，Zoom调节电子放大倍率。点击Stop点击Beam path中的save键，保存个人的扫描方法7、点击single键扫描

8、获取图像8、save保存图像到硬盘上。多荧光标记1、按Acquire按钮中的Beam键打开光路设置对话框窗口2、点击Mode选择扫描模式xyz3、点击Format选择扫描像素512x512或1024x10244、点击Average line / frame average选择获取图像时平均的次数5、双击相应荧光素或染料方法，如FITC6、点击continuous，优化图像质量点击Q LUT使图像颜色变为伪彩Glow O&U模式，用快捷钮Z Position调节到最佳层面， 用相应PMT调节荧光亮度，Zoom调节电子放大倍率。Stop点击Beam path中的save键，保存个人的扫描方法其他荧

9、光同样操作后7、点击Beam path中Sequential Scan，将个人的多种荧光扫描方法添加到面板中，选择betweenframes obetween lines各个通道一线一线分先后扫描几乎同时成像between frames各个通道分先后扫描先后成像 （多用此法）between stacks多层扫描中，先扫完一个通道的多层，再扫另一个通道的多层8、点击series键扫描图像9、 点击overlay获取叠加图像，选中叠加图片，单击右键send to - experiment -selection （raw）（保存选中的图片的原始格式，扫描像素一定，固定大小，单通道图片可以在leica

10、软件中再编辑，overlay图片不能再编辑）selection （snapshot）（保存选中的图片的抓图模式，显示大小）All Snapshot（保存抓图模式，整个窗口）9、save保存图像到硬盘上。DIC图像扫描1、 将显微镜DIC棱镜调整至与观察用镜头倍数相配，如镜头为63x，DIC棱镜就调到40/60 的位置2、镜头侧棱镜由BF调整到与观察用镜头型号相配，如镜头标示为8/0.17/D，棱镜就调到D3、双击Beam path面板方法中的Transmission4、点击continuous，优化图像质量用快捷钮Z Position调节到最佳层面，打开signal面板，用signal面板中T

11、r PMT Gain调节图像亮度，Tr offset调节图像对比度（值不宜过小），Zoom调节电子放大倍率。点击Beam path中的save键，保存个人的DIC扫描方法5、点击single键扫描获取图像6、save保存图像到硬盘上。荧光与DIC图像同时扫描1、 将显微镜DIC棱镜调整至与观察用镜头倍数相配，如镜头为63x, DIC棱镜就调到40/60 的位置2、镜头侧棱镜由BF调整到与观察用镜头型号相配，如镜头标示为8/0.17/D，棱镜就调到D3、双击Beam path面板方法中的Transmission4、点击continuous，优化图像质量用快捷钮Z Position调节到最佳层面，

12、打开signal面板，用signal面板中Tr PMT Gain调节图像亮度，Tr offset调节图像对比度，Zoom 调节电子放大倍率。点击Beam path中的save键，保存个人的DIC扫描方法荧光图像扫描方法如前保存5、点击Beam path中Sequential Scan，将个人的荧光扫描方法和DIC扫描方法添加到面板中， 选择 between frames。6、点击series键扫描图像7、点击overlay获取叠加图像，选中叠加图片，单击右键send to - experiment - selection （raw）（保存选中的图片的原始格式，扫描像素一定，固定大小，单通道图片

13、可以再编辑，overlay图片不能再编辑）selection（snapshot）（保存选中的图片的抓图模式，显示大小，图片不再能编辑）All Snapshot（保存抓图模式，整个窗口，图片不再能编辑）8、save保存图像到硬盘上。多层扫描1、点击continuous，优化图像质量用快捷钮Z Position调节不同层面，点击Q LUT使图像颜色变为伪彩Glow O&U模式观 察样品荧光强度，相应PMT调节荧光亮度，Zoom调节电子放大倍率。然后选择需要扫描 的起始、终止层面，分别按begin、end键，保存起始、终止层面位置，select选择扫描的张 数Others可以自由选择扫描层数或是扫描

14、厚度2、单荧光标记样品直接点击series键扫描图像多荧光标记样品 点击Beam path中Sequential Scan，将个人的多种荧光扫描方法添加到 面板中，选择between frames，点击series键扫描图像。3、save保存图像到硬盘上。多层图像的叠加（一）平面叠加选中多层图像的原始文件，点击process面板中的3D projection maximum apply（二）动态叠加1、选中多层图像的原始文件，点击process面板中的3D projection animation maximum2、Rotation面板，图像旋转围绕的轴角度。选择animation面板。选择f

15、rame叠加张数，选择旋转方式：full turn 360度旋转，half turn 180 度旋转，quarter turn 90度旋转，angle自定义角度旋转。3、Apply生成3d文件，右键选中文件，Export .avi格式的文件，可以选择播放的速度。时间序列扫描（一）固定时间间隔1、按Acquire按钮中的Beam键打开光路设置对话框窗口2、点击mode中带时间的扫描模式：xyt3、点击continuous，优化图像质量4、点击Time Series面板，选择扫描间隔时间AT或选择最小扫描间隔Minimize，选择扫描 张数Frames，点击Complete time生成总时间5、

16、点击series开始扫描6、save保存图像到硬盘上选中扫描好的文件，右键Export .avi格式的文件（二）多个时间间隔组合1、按Acquire按钮中的Beam键打开光路设置对话框窗口2、点击mode中带时间的扫描模式：xyt3、点击continuous，优化图像质量4、点击Time Lapse面板，就第一个时间段进行定义，点击Start，再点击Time Series面板， 选择扫描间隔时间AT或选择最小扫描间隔Minimize,选择扫描张数Frames，点击Complete time生成总时间再依此定义第二个时间段。5、点击series开始扫描。6、save保存图像到硬盘上多重荧光图像扫

17、描结合Sequential Scan即可。光谱扫描只能进行单激发单通道接受。1、按Acquire按钮中的Beam键打开光路设置对话框窗口2、点击mode中带入的扫描模式：xy入3、双点击接受光谱条，选择光谱开始接受范围如：500nm520nm，点击K begin，再选择结束接受范围如：700nm720nm，点击K end（光谱最小接受范围5nm）4、点击select选择扫描张数。5、点击continuous，稍稍优化图像质量6、点击series开始扫描7、save保存图像到硬盘上ROI扫描1、按Acquire按钮中的Beam键打开光路设置对话框窗口2、点击Mode选择扫描模式，如平面扫面xyz

18、3、点击Format选择扫描像素，一般用512x512或1024x10244、点击Average line / frame average选择获取图像时平均的次数：4-8次5、双击相应荧光素或染料方法，如FITC、TRITC等6、点击continuous，优化图像质量用快捷钮Z Position调节到最佳层面，点击Q LUT使图像颜色变为伪彩Glow O&U模式（观察样品荧光强度），用相应PMT调节荧光亮度，Zoom调节电子放大倍率。点击Stop点击Beam path中的save键，保存个人的扫描方法7、扫描laser强度降到08、点击ROI，画出感兴趣区域，点击config，选中相应lase

19、r， ok9、扫描laser强度恢复到开始状态。10、点击single键扫描获取图像。11、save保存图像到硬盘上。荧光强度分析1、按quality按钮Profile（线性荧光强度分析）一条线上的荧光强度Histogram（面积荧光强度分析）ROI区域的大小及其中的平均荧光强度Stack profile （多层荧光强度分析）某区域内多层荧光强度的变化Material（材料的分析）2、选择某一种分析方式后，Viewer图像上画线段或ROI区域Graph 所画线段或ROI区域的荧光强度曲线Statistics所画线段或ROI区域的荧光统计数据3、Generate report 将数据导出Save

20、 report as 将 Viewer、Graph、Statistics 显示的图像、数据保存Export as将Graph、Statistics显示的数据保存为文本格式Applications（一）FRAP1、设置漂白及漂白前后参数漂白前扫面几张图像，每张图像的间隔时间漂白几次漂白后扫描几张图像，每张图像的间隔时间2、设置漂白区域、漂白光源及光强度3、running4、荧光恢复数据的统计5、report保存导出数据（二）FRET1、设置并保存扫描donor和accepter的参数2、设置漂白区域、漂白光源及光强度，和漂白次数3、run4、荧光共振能量传递数据5、report（三）LIVE M

21、ODE1、Basic单一时间间隔2、Advanced多时间间隔组合Job 1 time intervals:扫描时间间隔Frames: infinite or numberNext job job 23、new 设置 job 2PROCESSING（一）Arithmetic and Boolean Logic图像的加、减、乘、除等算法（二）Conversion图像比特的转换（三）Editing图像的合并、拆分（四）Enhancement图像亮度、对比度、gamma值、phase （位移）等参数的调整（五）Extend Focus从3D图像转成2D图像（六）Image Filers滤镜功能（七）Materials材料分析（八）Dye finder荧光染料划分（九）Segmentation图像分割（十）3D visualization and animation图像投影及动画