载体构建的基本步骤
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1、载体构建一、原理依赖于限制性核酸内切酶,DNA连接酶和其他修饰酶的作用,分别对目的 基因和载体DNA进行适当切割和修饰后,将二者连接在一起,再导入宿主细胞, 实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。二、操作步骤1、摇菌(制作感受态细胞备用)取装有液体培养基的3:试管两支(依情况而定),每管加40-100rl菌种,过夜摇。2、提质粒(也就是载体)依照提质粒试剂盒中的说明书操作(根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次)。3、酶切(双酶切产生粘性末端)反应所需试剂体积(单位:ul)质粒10所需内切酶反应缓冲液2所需限制性内切核酸酶1H2O7将加好的EP管置于37C保温1-2h。(依照提酶切的具体步骤操作
2、;为了达到最佳酶切 的效果,最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度)4、电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳,检测酶切是否成功。回收胶:琼脂糖与缓冲液一比一制胶,经过切胶回收目的产物,也有目的产物纯化的功能;检测胶:琼脂糖与缓冲液一比二制胶,为了检测目的条带与预期是否相符。切胶回收与产物纯化是差不多的过程,所达到的目的是一样的:切胶回收也是一种纯化过程,它能去除非目的片段,然后用回收试剂盒进行纯化,能将很不纯的DNA溶液纯化;产物纯 化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质,用纯化试剂盒,你会发现纯化试剂盒和回 收试剂盒的步骤几乎一样。5、载体与目的基因连接如果电泳检测酶切成功的话,则仔细将
3、所需的片段切割下来,将胶体回收(依照胶回收 试剂盒说明书操作);之后将回收的片段和载体连接。置于温箱,12-16C,保温8-16h6、转化(连接产物转化到感受态细胞中)依照转化具体操作步骤做感受态,将上述连接产物进行转化实验,涂板培养,37C, 12-16h。7、单克隆检测(1)挑单克隆先将AMP从冰箱中取出,待融化后,在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3叫的AMP,用枪头混匀;取1.5 mlEP管5支(依情况可以多挑几管),给每支管中加500叫上述 培养液,然后用接种环(或黄枪头)挑单克隆,挑完后用枪吹打;之后,将挑好的菌摇4-5 小时,至混浊即可。(2)单克隆检测以每管摇好的菌液为模板
4、,以原有的引物进行PCR,然后将PCR产物跑电泳,观察电泳图 像中那几管的条带正确,将正确条带相对应管的菌液再抽取100rL,加到3ml (有LB液体 培养液,AMP+)试管中,过夜摇;第二天重摇,将摇好的菌取1ml于1.5mlEP管中送测序, 并保种。注:挑单克隆时,一定要挑单一圆润的菌落,有卫星斑的不挑。 别忘记往培养基中加AMP。 用接种环挑菌后,要在酒精灯上反复灼烧,然后再进行下一次挑菌。三、注意事项1. 连接产物可短时间在-20C保存,使用时可以取出进行后续实验;2. 在细胞转化时,冰浴和热激要严格控制好时间;3. 连接反应是DNA重组过程中的关键步骤,其成败的重要参数之一就是温度,因此要控 制好连接温度。4. 进行黏末端连接时,会产生一定数量的载体自身环化分子,导致转化菌中过高的假阳性克隆背景。针对这一问题,常采用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)去掉载体的5-磷酸以抑制DNA片段的自身环化。
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