生物化学实验指导

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1、生物化学实验指导实验室规则一、实验目的生物化学是医学教育中的一门实践性较强的基础学科。实验教学是过程的重要组成部分，是理论教学的延伸和补充。实验目的是：1、 初步学会生物化学实验的基本操作技能及实验研究的基本方法。2、 熟悉生物化学实验原理，了解一些临床生化检验项目。3、 培养严肃认真的工作方法、实事求是的科学态度、团结协作的工作作风和观察分析、思考、独立解决问题的能力。二、实验基本要求实验教学包括实验前准备、实验操作、整理实验结果、书写实验报告等环节，为了提高实验效果，实现实验目的，要求学生必须做到以下几点。（一） 实验前1、 仔细阅读实验指导，了解实验目的和要求，充分理解实验原理，熟悉实验

2、步骤、操作程序和注意事项。2、 预测实验各个步骤可能得到的结果，对预期实验结果能做出合理的解释。3、 注意和估计实验中可能发生的误差，并制定防止误差的措施。（二） 实验时1、 保持实验室肃静，不能进行与实验无关的活动。2、 在教师或实验技术人员的指导下，熟悉仪器的构造、性能及操作规程。3、 实验器材摆放整齐，有条不紊、装置正确。4、 按照实验步骤，严肃认真的循序操作，不能随意更动。5、 爱护公物，注意节省实验器材和药品。注意安全，严防触电、火灾、酸碱灼伤及中毒事故的发生。6、 仔细、耐心地观察实验田中出现的现象，随时客观的记录实验结果，以免发生错误或遗漏。实验条件应始终保持一致，如有变动,应加

3、文字说明。（三） 实验后1、 整理实验结果，书写实验报告，按时交给指导教师评阅。2、 整理实验仪器和清洗玻璃仪器，关闭仪器、设备和电源。清点实验器材，办理借还手续。3、 做好实验室清洁卫生工作，关闭水、气阀门，切断电源，关闭门窗，确保安全。实验一 生化实验基本操作一、实验目的通过基本操作训练，学会熟练进行进行玻璃仪器洗涤；吸量管使用；溶液的混合；离心机使用；型分光光度仪使用。二、实验用品烧杯、试管；吸量管、移液管；旋涡混合（振荡）器、玻璃棒；离心机使用；型分光光度仪三、实验内容及步骤（一）玻璃仪器的洗涤在生化实验中，玻璃仪器洁净与否，是获得准确结果的重要环节。洁净的玻璃仪器内壁应十分明亮光洁，

4、无水珠附着在玻壁上。（二）吸量管的使用1刻度吸量管的正确使用方法用右手拇指和中指夹住管身，将吸量管的尖端伸入试液深处，左手持洗耳球把试液吸入管内至高过刻度以上时，迅速用右手食指按住吸量管的上口，以控制试液的泄放。吸液后应尽量使吸量管保持垂直，使右眼与刻度等高，稍微轻抬食指或轻轻转动吸量管，使试液面缓慢降落，至管内试液弯月面的最低点与吸量管的刻度线相齐为止。然后将吸量管插到需加试剂的容器中，让尖端与容器内壁靠紧，松开食指让液体流出。液体流完后再等15秒钟，捻动一下吸量管后移去（如需吹的吸量管，则吹出尖端的液体后再捻转一下吸量管移去）。 2定量吸液器的使用方法(微量加样器)： 1) 选择适当的吸液

5、器：吸液前先把吸嘴套在吸引管上，套上后要轻轻旋紧一下，以保证结合严密。2) 持法：右手四指（除大拇指外）并拢握住吸液器外壳（使外壳突起部分搭在食指近端），大拇指轻轻放在吸液器的按钮上。3) 取样(吸液)：用大拇指按下按钮到第一停止点，以排出一定容量的空气，随后把吸嘴尖浸入取样液内，徐徐松开大拇指，让按钮慢慢自行复原，取样即告完成。4) 排液：将吸液器的吸嘴尖置于加样容器壁上，用大拇指慢慢地将按钮按下到第一停止点，停留1秒钟（粘性较高的溶液停留时间应适当延长）。然后再把按钮按到第二停止点上，让吸嘴沿管壁向上滑动。当吸嘴尖与容器壁或溶液离开时，方可释放按钮，使其恢复到初始位置。5) 吸液器用后应及

6、时取下吸嘴。将吸嘴用自来水冲洗后浸入盛水的容器内（以防干涸），待实验结束后集中仔细清洗。（三）溶液混匀 1混匀的方法1) 使盛器作离心运动。2) 左手持试管上端，用右手指轻击试管下半部，使管内溶液作旋转运动。3) 利用旋涡混合（振荡）器混匀。4) 不得已时可用干燥清洁的玻璃棒搅匀。（四）离心机使用1TGL-20M台式离心机使用方法操作程序： 1）把离心机放置于平面桌或平面台上，四只橡胶机脚应坚实接触平面，目测使之平衡，用手轻摇一下离心机，检查离心机是否放置平稳。 2）打开门盖，将离心管放入转子体内，离心管必须成偶数对称放入（离心管试液应称量加入），注意把转子体上螺钉旋紧，并重新检查试管是否对称

7、放入、螺钉是否旋紧。3）关上门盖，注意一定要使门盖锁紧，完毕用手检查门盖是否关紧。 4）插上电源插座，按下电源开关。 5）设置转子号、转速、温度、时间：（五）分光光度仪使用721型1）721分光光度计使用前应预热20分钟，做样之前应对比色皿成套性进行校正，减小测量误差。2）波长选择置于所要分析物相对应的波长值，3）打开比色皿盖进行调零调整面板0旋钮进行零点调整。4）将空白放入比色皿盒后盖上比色皿盖，调整100旋钮进行100%调整。5）然后逐一拉出样品进行比色分析。四、实验报告与内容（略）五、注意事项（一）使用刻度吸量管的注意事项：1) 选择适当规格的吸量管：吸量管的最大容积应等于或略大于所需容

8、积（ml数）。2) 仔细看清吸量管的刻度情况：刻度是否包括吸量管尖端的液体？读数方向是从上而下，还是从下而上？3) 拿吸量管时，刻度一定要面向自己，以便读数。4) 吸取试剂时应注意三点：一是先吹去吸量管内可能存在的残留液体，二是将吸量管插入试剂液面深部(以免吸液过程中因液面降低而吸入空气产生气泡或管内试剂进入洗耳球)，三是使用洗耳球(不可直接用口吸)。5) 按吸量管上口时应该用食指，不能用拇指。6) 吸取粘滞性大的液体(如血液、血浆、血清等)时，除选用合适的吸管(奥氏管)外，应注意拭净管尖附着的液体，尽量减慢放液速度(用食指压力控制)，待液体流尽后吹出管尖残留的最后一滴液体。使用的吸量管应干净

9、、干燥无水。如急用而又有水时，可用少量欲取试剂冲洗3次，以免试剂被稀释。（二）溶液混匀注意事项：1) 防止盛器内的液体溅出或被污染。2) 严禁用手指堵塞管口或瓶口震荡混匀。六、思考题1、吸取某标准液0.75ml，应选用 ml的吸管移取。2、去油污能力最强的洗液是 。3、配制0.4M NaOH溶液1000ml，需NaOH 克。4、配制0.5M HCL 400ml，需1M HCL溶液 毫升。实验二 尿蛋白定性实验一、实验目的通过接触尿蛋白定性实验，初步学会判断和了解肾脏功能是否出现问题及问题的严重性二、实验原理在含有蛋白质的尿液中另磺柳酸时，可产生白色沉淀。是磺柳酸的酸离子可与蛋白质碱性基团结合，

10、生成不溶性蛋白盐深沉。三、实验用品与试剂配制尿杯、试管、滴管、20%磺柳酸溶液四、实验内容及步骤1、采集尿液标本：用尿杯采集自己的尿液标本备用。2、取试管一支，加入清晰的尿液24滴，然后加入20%磺柳酸溶液2滴，轻轻摇匀，一分钟后观察结果。3、结果记录和判断：尿蛋白定性实验是尿常规检查中必做的一项实验，是诊断肾脏疾病和病变的重要常规指标之一。尿蛋白定性试验常通过半定量方式或加号方式检测尿液中排出的蛋白质的多少，用于判断和了解肾脏功能是否出现问题及问题的严重性，其结果可用阴性、微量、1-4个加号+表示，也可用数值表示，加号越多或数值越高则尿蛋白越多。五、实验报告与内容此次实验结果为 六、注意事项

11、 收集中段尿七、思考题试讨论尿蛋白定性实验临床意义实验三 蛋白质的性质实验 一、实验目的学会验证蛋白质呈色反应、沉淀反应及等电点的实验操作。二、实验原理蛋白质分子中的氨基酸是以肽键连接的，因此蛋白质具有缩二脲反应。由于蛋白质分子中含有自由氨基，可与茚三酮试剂作用生成紫蓝色化合物，称茚三酮反应。以上呈色反应可用于检验蛋白质。在蛋白质溶液中加入中性盐时，蛋白质即沉淀，这种过程称为盐析。盐析包括：（1）大量电解质破坏蛋白质的水化层而出现沉淀；（2）电解质中和了蛋白质分子的电荷而沉淀。中性盐能否沉淀各种蛋白质决定于中性盐的浓度、蛋白质的种类、溶液的pH、以及蛋白质胶体颗粒的大小。颗粒大的比颗粒小的容易

12、析出，如球蛋白多在半饱和(NH4)2SO4溶液中析出，而清蛋白则常在饱和(NH4)2SO4溶液中析出。极性较大的有机溶剂，对水的亲和力较大，可破坏蛋白质的水化层使其沉淀；当溶液的pH值大于蛋白质的等电点时，蛋白质带负电荷，可与重金属离子结合成蛋白盐沉淀；在溶液的pH值小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，可与酸根离子结合成蛋白盐沉淀。蛋白质解离成两性离子时，溶液的pH值称该蛋白质的等电点。酪蛋白溶液在等电点时很不稳定，可以发生沉淀。所以，可以根据相对浊度来测定酪蛋白的等电点的近似值。三、实验用品与试剂配制1、蒸馏水 2、10% 鸡蛋白溶液 (v / v ) 3、0.2 %茚三酮乙醇液 4、固体

13、(NH4)2SO45、0.5% NaOH溶液 6、0.5% 硫酸锌溶液 7、10% 三氯乙酸溶液 8、0.01 mol/L醋酸9、0.1 mol/L醋酸 10、1.0mol/L醋酸11、饱和(NH4)2SO4溶液： 称取377 g硫酸铵溶于20500ml的蒸馏水中。硫酸铵在20水中的溶解度为754g/L水。配制时需称取稍过量的硫酸铵使溶液中有少量固体存在，同时可加热助溶。12、0.5%酪蛋白醋酸钠溶液：称取纯酪蛋白0.25g，置于50ml容量瓶内，准确地加蒸馏水20 ml及1mol/L NaOH 5ml，摇匀，使酪蛋白溶解，然后准确地加1mol/L醋酸液5ml，最后用蒸馏水稀释至刻度。13、滴

14、管、试管和试管架、记号笔。四、实验内容及步骤（一）茚三酮反应 取小试管1支，加10 %鸡蛋白溶液4滴，蒸馏水10滴和0.2 %茚三酮乙醇液6滴，混匀，在沸水浴中加热510分钟，待冷却后观察溶液的颜色变化。（二） 沉淀反应 盐析：取10%鸡蛋白溶液4ml于小试管中，再加入4ml 饱和(NH4)2SO4溶液，混匀，静置20分钟后，则球蛋白全部析出。离心（2000转/分钟）5分钟，取上清液1ml加固体(NH4)2SO4约0.5g 使之饱和，边加边振摇至溶液出现浑浊，再向浑浊液（应不含硫酸铵结晶颗粒）加1.52.0ml蒸馏水，观察结果。 重金属盐沉淀蛋白质：取试管1支，加入10%鸡蛋白溶液1ml，及0

15、.5%NaOH溶液1滴混匀，再加入0.5%硫酸锌溶液6滴，观察结果。 三氯乙酸沉淀蛋白质：取试管1支，加入10%鸡蛋白溶液1ml，然后再加入10%三氯乙酸溶液35滴，观察沉淀的生成。（三）蛋白质等电点的测定： 取5个大试管，编号，按下表准确加入试剂，混匀。 试管号试 剂 (ml)12345蒸馏水8.48.78.08.27.40.01mol/L醋酸0.60.1mol/L醋酸0.31.01. 0mol/L醋酸0.81.60.5%酪蛋白醋酸钠溶液（加入方法见后）1.01.01.01.01.0溶液pH值5.95.34.74.03.5浊度比较 各试管加入酪蛋白醋酸钠溶液时，应随加随摇（切勿在各管加完后才

16、摇），观察各管浊度。静置1030分钟后，比较各管浊度，用（）多少表示其浑浊程度。沉淀最多而上清液最透明的试管的pH值，即为酪蛋白的等电点。为什么？五、实验报告与内容（一）茚三酮反应结果（二） 沉淀反应结果（三）蛋白质等电点的测定沉淀最多而上清液最透明的试管的pH值= ，即为酪蛋白的等电点。为什么？六、注意事项缓冲液的pH值必须准确。七、思考题1、根据实验观察结果，指出PH值为 是酪蛋白的等电点。2、酪蛋白在 时，溶解度 ，容易沉淀。3、各试管中酪蛋白带什么电荷：1 2 3 4 5 。4、蛋白质变性的机理是什么？哪些因素引起蛋白质的变性？5、根据你这次的实验观察讨论变性与沉淀的关系。6、什么是蛋

17、白质的等电点？7、在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？实验四 温度、pH、激动剂和抑制剂对酶促反应速度的影响一、实验目的 学会温度、pH、激动剂和抑制剂对酶促反应影响的实验操作。二、实验原理 温度与酶促反应速度关系密切。温度降低酶促反应速度降低以至完全停止；随着温度升高，反应速度逐渐加快。在某一温度时反应速度达到最大值，此温度称酶作用的最适温度。温度再升高，反应速度反而下降。人体内大多数酶的最适温度在37左右。 PH值影响酶促反应速度，是由于酶本身是蛋白质。PH不仅影响酶蛋白分子某些基团的解离，也影响底物的解离程度，从而影响酶与底物的结合。当酶促反应速度达到最大值时的溶液pH值，称为该酶

18、的最适pH。不同的酶最适pH值不尽相同，人体多数酶的最适pH值在7.0左右。例如唾液淀粉酶的最适pH值为6.8。 凡是能够提高酶活性，加快酶促反应速度的物质都称为酶的激动剂。例如Cl-是唾液淀粉酶的激动剂。 凡是能够降低酶的活性，使酶促反应速度减慢，又不使酶变性的物质称为酶的抑制剂。例如Cu2+是唾液淀粉酶的抑制剂。三、实验用品与试剂的配制1、滴管、试管和试管架、恒温水箱、记号笔。2、0.1淀粉液 3、0.3NaCl溶液 4、0.5 CuSO4溶液 5、蒸馏水 6、不同pH值缓冲溶液的配制: 1/15mol/L KH2PO4液：称取纯KH2PO4 9.078g加蒸馏水溶解并稀释成1000ml。

19、1/15mol/L Na2HPO4 液：称取Na2HPO4 2H2O 11.815g，加蒸馏水溶解并稀释成1000ml。上述两液下列比例混合均匀，即可得到不同pH值的缓冲溶液。pH4.926.818.671/15mol/L KH2PO49.95.00.11/15mol/LNa2HPO40.15.00.9四、实验内容与步骤制备稀唾液：用清水漱口，含蒸馏水少许，咀嚼刺激唾液分泌。取唾液2ml加蒸馏水18ml混匀备用。（一） 温度对酶促反应速度的影响 1.取试管3支，编号，按下表依次加入各种试剂。试管号试剂（ml）1230.2淀粉溶液555PH 6.8缓冲液1110.3NaCl溶液111 2.混匀后

20、，将1号、2号、3号试管分别置于沸水浴、温水浴（3740）和冰水浴中5分钟，此间振荡之，使温度达到平衡。然后向各试管中加入稀唾液1ml混匀，15分钟后取出，并向各试管加碘液1滴，观察颜色变化并予以分析。（二）pH对酶促反应速度的影响 1. 取试管4支，编号，按下表依次加入各种试剂。试管号试剂（ml）12340.2淀粉液5555PH 4.92缓冲液2PH 6.81缓冲液22PH 8.67缓冲液20.3 NaCl溶液1111 2. 混匀后，将各管置于温水浴（3740）中保温5分钟，此间振荡之，使温度达到平衡。然后向1、2、3号试管中加入稀唾液1ml，4号试管中加入蒸馏水1ml（作为对照），混匀，立

21、即放回温水浴，继续保温15分钟后取出，并向各试管加碘液1滴，观察颜色并解释结果。（三）激动剂和抑制剂对酶促反应速度的影响 1. 取试管3支，编号，按下表依次加入各种试剂。试管号试剂（ml）1230.2 淀粉液333PH 6.81缓冲液111蒸馏水10.3 NaCl溶液10.5 CuSO4溶液1稀唾液111 2. 混匀后，将各管置于温水浴（3740）中保温15分钟后，取出。冷却后分别加碘液1滴，观察颜色变化并解释结果。五、实验报告与内容(一) 温度对酶促反应速度的影响观察颜色变化并予以分析。(二) pH对酶促反应速度的影响观察颜色并解释结果。(三) 激动剂和抑制剂对酶促反应速度的影响观察颜色变化

22、并解释结果。六、注意事项1唾液淀粉酶活性存在个体差异，同时受稀释倍数影响，收集时应事先确定稀释倍数，或收集2-3人的浊合唾液。2根据实验室条件通过预测，确定最佳保温时间。七、思考题说明PH、温度、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响。实验五 血清总蛋白、清蛋白及AG比值测定一、实验目的1学会血清总蛋白(双缩脲比色法)、血清清蛋白(BCG法)测定的原理、试剂配制及结果计算 2熟练进行实验基本操作并能遵照注意事项操作 3正确使用生化实验室常规仪器二、实验原理蛋白质分子中的肽键在碱性条件下，与Cu2+产生紫红色络合反应，与缩二脲在碱性溶液中与Cu2+的反应相似，故称为双缩脲反应。产生的颜色强度在一定范

23、围内与蛋白质的含量成正比，与同样处理的蛋白标准液比较，经计算或查标准曲线即可求出血清总蛋白质含量。三实验用品与试剂配制 1、6molL氢氧化钠溶液 称取氢氧化钠(NaOH，优级纯)240g，用新鲜蒸馏水配制成1L，置室温贮存在密封的聚乙烯瓶里。 2、双缩脲试剂 称取未失结晶水的硫酸铜(CuSQ5H20)30g，溶于500m1新鲜蒸馏水中，加酒石酸钾钠(NaKC4H4O6。4H2O)90g，碘化钾(KI)50g，待安全溶解后，加入6molL氢氧化钠溶液100ml，最后加蒸馏水至1L。室温贮存在密闭的聚乙烯瓶里，约稳定6个月。 3、蛋白标准液 可用商品血清蛋白标准液或定值质控血清为标准。亦可收集混

24、合新鲜血清，用凯氏定氮法标定后，加叠氮钠防腐(叠氮钠的终浓度0510gL)，冰冻保存。 4、恒温水浴箱、分光光度计、吸管、试管。四. 实验内容与步骤 （一）标准曲线的操作步骤配制20gL蛋白标准液 如蛋白标准液浓度为70gL，则取此液2m1，加入新鲜蒸馏水5ml，混匀即成。加入物（ml）空白管1234520g/L蛋白标准液0.10.20.30.40.5蒸馏水0.50.40.30.20.1双缩脲试剂3.03.03.03.03.03.0相当血液蛋白质（g/L）20406080100混匀，置37水浴10min(或2530min)，用540nm波长比色，以空白管调零，读取各管吸光度。（二）标准曲线绘制

25、（三）样品测定操作加入物（ml）测定管标准管空白管血清0.1蛋白标准液0.1蒸馏水0.40.40.5双缩脲试剂3.03.03.0五、实验内容与报告标准曲线绘制实验结果：A测= 根据测定管吸光度，从标准曲线查找相对应的总蛋白浓度。C测=六、注意事项 1血清标本以新鲜为宜，但在冰箱保存而不混浊的标本也可应用，含脂类极多的血清加入试剂后仍浑浊不清，可用乙醚抽提后在比色。 2双缩脲试剂要密闭贮存，防止吸收空气中的二氧化碳。 3试管、吸管应清洁，否则会有混浊现象出现。 4明显溶血标本可干扰双缩脲反应，故不宜使用。 5黄疸血清可使结果偏高，最好做相应的血清空白，以保证结果准确。 6各种血清蛋白与双缩脲试剂

26、的显色基本相同，但其他类蛋白质的显色强度与血清强度与血清蛋白有很大差别，故不可随意选用未知性能的蛋白质作为血清蛋白测定的标准。七、思考题测定血清总蛋白及白、球比值有什么临床意义?实验六 转氨酶活性测定一、实验目的本实验要证实肝脏中GPT(ALT)活力较高。二、实验原理本实验以动物肝组织、肌肉组织为标本，观察这些组织中转氨酶(ALT)的活性大小。 GPT的底物：丙酮酸与a-酮戊二酸在pH 7.4时，经组织匀浆中GPT催化进行转氨基作用，生成丙酮酸和谷氨酸。丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸-2，4-二硝基苯腙，后者在碱性溶液中显棕红色。棕红色深浅与酶活力大小成正比，用颜色深浅来比较肝脏和

27、肌肉中GPT活力。反应式如下：三、实验用品1匀浆器(或组织捣碎机或研钵)、滴管、试管和试管架、恒温水箱、记号笔。20.1molL pH7.4磷酸盐缓冲液。精确量取0.1molL Na2HPO480.8毫升，0.1molL KH2P0419.2毫升，混匀即成。 3GPT底物液。称取DL-丙氨酸1.73克，a-酮戊二酸29.2毫克。将两种物质先溶于10毫升lmolL NaOH中，待溶解后，以1molL HCI校正到Ph7.4，再加pH7.4磷酸盐缓冲液至100毫升，加氯仿数滴防腐，置冰箱备用。 42，4-二硝基苯肼溶液。称取2，4-二硝基苯肼20毫克溶于100毫升1molL HCl中(可略加温助溶

28、)。 50.4molL NaOH。取16克NaOH溶于500毫升蒸馏水中，再加蒸馏水稀释至1000毫升。四. 实验内容与步骤1将家兔处死后，立即取出肝和肌肉，分别以冰生理盐水洗去血液，取10克新鲜肝和10克肌肉组织，分别剪碎，各加pH7.4磷酸盐缓冲液10毫升，用匀浆器或研钵等制成肝匀浆和肌肉匀浆，再加pH7.4磷酸盐缓冲液20毫升混匀，制成酶浸出液。 2取试管三支，编号1、2、3，按表操作试 剂 （滴）管 号123GPT底物液101010肝匀浆3肌匀浆3Ph7.4缓冲液337，水浴20分钟2，4-二硝基苯肼55537，水浴30分钟0.4mol/L NaOH5ml5ml5ml5至10分钟后，观

29、察结果。五、实验报告与内容观察各管颜色深浅结果，并加以说明。六、注意事项1、酶的活力测定与温度、时间影响很大，因此反应严重控制温度和注意掌握时间。2、光密度与丙酮酸的标准线成抛物线，是因为除丙酮酸与2.4二硝基苯肼在碱性溶液中能成腙外，酮戊二酸亦能与2.4二硝基苯肼产生苯腙。这是本实验方法的缺点。七、思考题转氨酶活性测定临床意义。实验七 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳一、实验目的叙述电泳法分离蛋白质的原理、及临床意义，熟练掌握操作方法。二、实验原理血清中各种蛋白质的等电点大都在pH7以下，将血清置于pH8.6的缓冲液中，蛋白质均带负电，在电场中都向阳极移动。因血清各种蛋白质在同一pH环境中所带负电荷

30、多少及分子大小不同，所以在电场中向阳极泳动速度不同。蛋白质分子小而带电荷多者，泳动速度快；反之则慢。因此可将血清蛋白质依次分为清蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、b-球蛋白和g球蛋白五条区带，经染色可计算出各血清蛋白质含量的百分数。 三实验用品1仪器：电泳仪、电泳槽、分光光度计。 2材料：醋酸纤维薄膜、培养皿、滤纸、镊子、加样器、直尺、铅笔、剪刀等。 3巴比妥巴比妥钠缓冲液(pH8.6，m=0.06)。称取巴比妥2.22克和巴比妥钠12.36克，溶于500毫升蒸馏水中，加热溶解。待冷至室温后，再加蒸馏水稀释至1000毫升。 4染色液。称取丽春红S0.4克及三氯醋酸6克；用蒸馏水溶解，并稀释至1

31、00毫升。 5漂洗液。3%(VV)醋酸溶液。 6透明液。取无水乙醇75毫升和冰醋酸25毫升混匀备用。 70.4molL氢氧化钠溶液。 840%(VV)醋酸溶液。四. 实验内容与步骤 1薄膜的准备：取醋纤薄膜(2厘米*8厘米)在毛面的一端约1.5厘米处，用铅笔轻划一直线，表露点样位置并编号。将此薄膜置于巴比妥缓冲液中浸泡，待充分浸透(即膜条无白斑时)后取出，用洁净滤纸轻轻吸去表面的多余缓冲液。 2点样：取少量血清置于玻璃板上，用加样器的取血清(约12ml)，随后均匀加在点样线上，待血清渗入膜后移开点样器。 3电泳：将已点样的薄膜加样面朝下，加样端置于阴极端，平整地贴于电泳槽的支架上拉直。支架上事

32、先放置好两端浸入缓冲液的用四层滤纸条作的“滤纸桥”。平衡数分钟至薄膜重又湿润时方可通电进行电泳。一般电压为100160伏，电流约0.40.6毫安厘米，通电时间4050分钟，待电泳区带展开约3.5厘米时断电。 4染色：小心取出薄膜，直接浸于丽春红S染色剂中510分钟(以清蛋白区带染透为止)。然后在漂洗液中连续浸洗数次，使薄膜底色漂净，即得五条蛋白色带。从阳极端起依次为清蛋白、a1、a2、和-球蛋白。 5定量及计算：将漂洗净的薄膜吸干，剪下各蛋白色带,另于空白部位剪一相当于清蛋白宽度的膜条做空白，分别置于0.4molL NaOH溶液的6支试管,并编号，清蛋白管加4毫升，其余各管加2毫升，振摇，使溶

33、液浸没膜条后，置37水浴10分钟，使其色泽浸出。再向各管加40%(VV)醋酸0.4毫升，清蛋白管则加0.4毫升，以中和部分NaOH，使色泽变红色。取各管上清液用分光光度计，在520nm处，以空白管调工作零点后。分别测得清蛋白管、a1、a2、和-球蛋白各管的吸光度值。 定量计算时，先计算各光密度值的总和： A T = 2A清 + A a1 + A a2+ A + A 再计算血清各部分蛋白质所占的百分率： Ax表示各球蛋白组分 (a1、a2、和) 的吸光度。 6.透明：若要保存薄膜，待薄膜完全干燥后，置透明液中1020分钟，取出贴于玻璃板上，干后则透明，可长期保存。 血清蛋白醋纤薄膜电泳的参考正常

34、值为： 白蛋白 6271 % a1-球蛋白 34 % a2-球蛋白 610 % -球蛋白 711 % -球蛋白 918 %五、实验报告与内容定量及计算：六、注意事项1. 点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不起，影响分离效果。2. 点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。3. 电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.40.6mA/cm膜宽度。电流强度高，则热效应高；电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。4. 操作过程为防止指纹污染，应戴手套。七、思考题醋纤薄膜电泳可将血清蛋白依次分哪几条?有何临床意义?