λ噬菌体的裂解性和溶原性5321

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1、 生命科学学院 噬菌体的裂解性和溶原性的基因调控机制 姓名：学号:班级：专业:摘要 噬菌体（phage）有两种生存策略，一种通过感染宿主细胞，产生大量的子代噬菌体，同时宿主细胞裂解死亡，这种方式称为裂解性感染。另一种是噬菌体的基因组以一种原噬菌体的方式潜伏于细菌中，这种增值方式称为溶原态（lysogeny）。噬菌体的裂解发育、溶原发育和溶原发育到裂解发育的诱导是研究生物分子调节优异的模型。经过四十多年的研究，在这个模型中已经发现了众多的正调节因子和负调节因子在转录水平或转录后调节基因的表达。关键词:噬菌体、裂解性、溶原性 目录 1.摘要 2 2.噬菌体的结构组成 3 壳体结构 3 噬菌体的核心

2、 3 3.噬菌体的生活周期 6 噬菌体 DNA 复制 6 噬菌体的转录调控 7 噬菌体的溶原性感染 9 噬菌体溶原化状态的建立 9 噬菌体基因组的整合 11 原噬菌体的割离 12 裂解性-溶原性选择决定 15 4.参考文献 16 1951 年 Esther Lederberg 发现 K12 菌株经 UV 诱发或偶尔自发放出噬菌体。K12 中有潜伏的、无感染能力状态的噬菌体，称原噬菌体。将这种噬菌体命名 为。侵 染后可 进入 裂解 周 期（lytic cycle）或 溶原 周期（lysogeny）。2.噬菌体的结构组成 壳体结构 噬菌体是有尾噬菌体，壳体由头部和尾部组成，头部和尾部通过颈部相连。

3、头部通常呈二十面体对称，直径为 60nm 左右；尾部呈螺旋对称，无收缩性。噬菌体头部蛋白主要有gpE(38kD)和 gpD(12kD)，他们以非二硫键进行共价连接。噬菌体的核心 噬菌体核心包含线状 dsDNA，分子量为，含有 48502bp，其双链 DNA 的两5端叫做 m 端,末端碱基为 G，为左向或反时针方向转录的链。R 链或右链5端称为 m端，末端碱基为A。DNA 被注入到宿主细胞后，可借助两5端单链的氢键缔合和连接酶的作用形成闭合环状DNA。由于噬菌体即可进行裂解生长，也可进入溶原化状态，因此噬菌体基因组的结构是与它的这些特性相适应的，其中一些基因决定裂解生长，另一些基因决定噬菌体的溶

4、原化，甚至还有一些基因可以对这两种状态的转变行使调节作用。噬菌体基因组 DNA 总长度为 48502bp，呈线状，当其DNA 进入细胞后和基因进行转录时则呈环状。根据DNA 的环状结构，可将 66个可编码的基因分成 3 个功能区(functional block)：右边的功能区参与衣壳形成和 DNA 复制，称为右操纵子区；左边的功能区与裂解生长和溶原化功能有关，xc 称为左操纵子区，中央功能区是基因组调控操纵子区，也称为免疫操纵子区。左图为噬菌体的基因图。（1）右操纵子区 A 至 J 为构成衣壳蛋白的基因，其中 S、R 基因与裂解作用有关。O、P 为 DNA 复制基因，与复制原点(ori)靠近

5、，Q 为抗终止因子基因。（2）中央调控操纵子区 cI 为阻遏物基因，其基因产物是噬菌体基因组早期转录的阻抑物；cro 为操纵基因 OL和 OR的阻抑物基因，其蛋白产物通过OR可抑制左向 cI 基因的转录。c基因产物能激活 cI 和 int 转录，与噬菌体进入或维持溶原化状态有关。（3）左操纵子区 N 是抗转录终止基因，N 基因产物能拮抗早期转录终止子tR1、tR2 和 tL1、tL2，使 PL和 PR的转录作用各自越过终止子区而继续向左和向右进行延伸转录。exo 和 bet 是位于 red 区域的两个基因，常被称为 red 基因，red 为重组相关的基因，其基因产物为核酸外切酶，参与裂解生长早

6、期所发生的重组，并能使 DNA 的 型复制转变为滚环复制。Gam 为大肠杆菌外切核酸酶 V 的抑制物基因，gam 基因产物可使宿主 recB 和 recC 基因编码的外切核酸酶失活，而外切核酸酶 V 则降解由滚环复制所产生的线状多联体 DNA。int 是整合酶基因，int基因产物能识别宿主细胞染色体 DNA 和噬菌体基因组上相应的 att 位点，并能催化二者的断裂和再连接。Att 位点称为附着位点，在宿主细胞 DNA 上称为attB，在噬菌体DNA上称为 attP,attB 和 attP 位点分别有一段由 15bp 组成的同源核苷酸序列，借助同源性重组作用可使噬菌体基因组插入到宿主的染色体DN

7、A 上。Xis 为切除酶基因。Int 和 xis 基因产物共同作用，能使att 位点发生重组，并将原噬菌体基因组 DNA 从宿主染色体中切割下来，使噬菌体进入裂解过程。在左区还有一个 c基因，它的基因产物可行使 c样的功能，即激活cI 和 int 的转录。在 b2 区域内的一些基因不是噬菌体存活和感染所必需的，它们包括 DNase、膜蛋白基因和 int 基因表达的调节位点。从噬菌体整个基因组来看，相邻基因之间的终止位点和起始位点常发生重叠。如在 ATGA 序列中，TGA 是前一个基因的终止密码子，而 ATG 则是后一个基因的起始密码子，像这样的重叠结构，噬菌体基因组中就有 30 个，整个基因组

8、很少有非编码区。表 1 噬菌体主要的调节元件及调节基因产物的功能 调节元件或 调节基因 产物及功能 PL,OL,PR,OR 左右向转录的启动子和操纵子 tR(1,2,3,4,5)右向转录的终止子 tL(1,2)左向转录的终止子 PRE C蛋白建立启动子，受 C蛋白调控 PI int基因启动子，受 C蛋白调控 PaQ Q 蛋白反义 RNA 启动子，受 C蛋白调控 PRM C蛋白基因维持启动子，受 C浓度调控 PR 晚期转录的启动子 nutL,nutR N 蛋白左右两个反终止结合位点 qut Q 蛋白反终止结合位点 cro PL和PR的阻遏蛋白，并可阻遏PE，抑制 CI 表达 cI PL 和PR

9、的主要的阻遏物，并可自主调控PRM c 可以启动PRE、PI 和PAQ，使进入溶原化途径 c 和 C组成复合物，启动PE产生c及cro的反义 RNA N tR1,tR2及tL1的反终止蛋白 Q tR4的反终止蛋白.O,P DNA 复制所需的蛋白 S,R,R2 裂解宿主所需的裂解酶 int 整合酶，使整合到宿主的染色体中 xis 切除酶，帮助在att位点和宿主连接 bet,exo 重组蛋白，帮助和宿主进行重组 W,B,N u3,C,D,E,F,F,Z 头部蛋白基因 U,V,G,T,H,M,L,K,I,J 尾部蛋白基因 cos(cohesive)12bp 的回文序列，由线状连接成环状的连接点，A

10、蛋白切割位点 A 末端酶，识别cos位点，包装时将环连体切成单个的基因组 3.噬菌体的生活周期 噬菌体 DNA 复制 噬菌体 DNA 复制分为早期复制和晚期复制。在早期和晚期复制阶段各具有不同的复制方式，早期为 复制，晚期为滚环复制。（1）复制 复制是从一个复制原点起始的，并且通过左复制叉和右复制叉产生双向复制。复制原点的组成：噬菌体的 复制原点存在于基因 O 区域内，由三个部分组成：一是 4 个高度保守的同向重复序列，由 19bp 组成，被称为 ori 重复序列；二是大约为 40bp 组成的 AT 富含序列，其中 AT 占 80；三是 28bp 组成的回文序列，中间不对称的部分含有 4bp，

11、见下图。复制的起始：DNA 复制是从复制原点起始的，ori 的 DNA 链解旋要有基因 O 和基因 P 产物的参与，然而基因 O 和基因 P 的转录却是通过右向启动子PR和右向操纵基因 OR 发动的。如果 cI 基因编码的阻遏蛋白结合在 PR 和 OR上，基因 O 和基因 P 就不能进行转录，DNA 复制也随之被阻断。通常基因 O和基因 P 一旦编码形成蛋白 0 和蛋白 P，蛋白 O 就可以识别和结合 4 个 ori 重复序列，并且再通过蛋白 P 同大肠杆菌的 dnaB 基因编码的解旋酶相互作用，构成复制复合体，后者与蛋白 O 在 ori 部位作用，使 DNA 双链解旋，然后由引发酶催化合成一

12、段引物 RNA，再在 DNA 聚合酶的催化下启动 DNA 复制，从 ori起始，DNA 呈双向复制。值得指出的是，在复制原点部位的 AT 富含序列具有两个方面的功能，一是 AT 富含区段呼吸作用强易于使 DNA 解旋。二是 AT 富含序列易于产生 RNADNA 合成的转变。DNA 所进行的 复制，没有固定的复制终点，当两个复制叉碰撞在一起的时候，复制便告终止。（2）滚环复制 在噬菌体进行裂解生长的晚期，早期蛋白合成关闭，衣壳蛋白和溶细胞蛋白开始合成，DNA 的复制也由 复制转变为滚环式复制。DNA 滚环复制为单向复制，故它又称为 复制，由滚环复制产生的多联体线状分子经内切酶识别并切开从粘性末端

13、 cos 位点，形成线状 DNA 分子。再经过衣壳蛋白将线性 DNA 分子包装在衣壳内。大肠杆菌的外切酶 V 能阻止噬菌体 DNA 滚环复制，但gam 基因产物能使这种酶失活。噬菌体的转录调控 噬菌体基因组的转录过程较为复杂，其DNA 的两条链都有各自的转录单位，r 链为右向转录，l 链为左向转录，一些在功能上密切相关的基因聚集而成几个大的转录单位，即 4 个操纵子，他们分别称为阻遏蛋白操纵子、左向早期操纵子、右向早期操纵子和右向晚期操纵子。阻遏蛋白操纵子含有 cI 基因，其产物 cI 蛋白为DNA 的阻遏蛋白；左向早期操纵子主要编码与重组、整合、割离有关的蛋白；右向早期操纵子主要编码与复制有

14、关的蛋白；晚期操纵子编码头部结构蛋白，还有溶菌酶，与噬菌体的裂解作用有关。晚期操纵子是一个大的操纵子，含有20 多个基因。噬菌体左右向早期操纵子并非是各自仅仅转录合成一条 mRNA，而是右向早期转录操纵子转录合成 3 种 mRNA（R1，R2 和 R3），左向早期转录操纵子转录合成两种 mRNA（L1 和 L2）。噬菌体 mRNA 的转录终止是通过依赖于 因子的终止子以及抗终止子来调控的。在左向早期操纵子中，具有一个依赖于 因子的终止子 tL1，宿主 RNA 聚合酶从左向启动子 PL转录至终止子 tLl，产生 L1mRNA；在右向早期操纵子中具有两个依赖于 因子的终止子 tR1、tR2 和一个

15、对于抗终止作用不敏感的终止子tR3，大肠杆菌聚合酶从右向启动子 PR开始转录合成 R1mRNA。L1mRNA 为基因 N转录产物，R1mRNA 为基因 cro 的转录产物，这两个基因均称为极早期基因，而两个左右早期转录操纵子的其他基因称为延迟早期基因。蛋白 N 能阻止终止子tL1、tR1 和 tR2 的终止作用，而使延迟早期基因得到表达，转录生成 L2、R2、R3 三种 mRNA,其中 L2 和 R2mRNA 编码合成与 cI 基因表达密切相关的 C和 C蛋白，以及 DNA 复制所需的 0 和 P 蛋白；R3mRNA 翻译合成 Q 蛋白。噬菌体的溶原性感染 噬菌体除了能产生裂解繁殖外，它的基因

16、组还可以被整合到宿主染色体DNA 上，并且长期存在于宿主细胞中。整合后的噬菌体基因组能随宿主 DNA 一起复制，当细菌分裂产生子代细胞时，其子代染色体 DNA 中都带有整合的噬菌体 基 因 组，这 种 噬 菌 体 基 因 组 的 整 合 作 用 就 称 为 噬 菌 体 的 溶 原 化（lysogenization）。染色体 DNA 上整合有噬菌体基因组的宿主细胞叫做溶原菌（lysogen）,而被整合的噬菌体基因组叫做原噬菌体（prophage）。噬菌体溶原化状态的建立 在噬菌体感染早期，宿主 DNA 聚合酶能识别 PR和 PL，并启动早期转录。基因 cro 依赖 PR启动子进行转录，其转录产物

17、编码合成 Cro 阻遏蛋白，Cro 蛋白是一种 DNA 结合蛋白，能结合于 OL 和OR的 CI 阻遏蛋白结合部位，Cro 蛋白通过结合于 OR中的 OR3 而干扰 RNA 聚合酶从 PRM起始基因 cI 的转录。然而，就在基因 cro 转录的同时，一种依赖于 PL启动子的基因 N 也已开始转录和合成 N 蛋白，由于 N 蛋白的抗终止作用，导致基因 c和 c的转录，编码合成 c和 c。在 c和 c蛋白的共同作用下，RNA 聚合酶转而识别抑制建立启动子 PRE，PRE左向启动转录，其转录方向与基因 cro 依赖 PR启动子的转录方向正好相反，而且转录作用经过基因 cro 一直延伸到基因 cI，结

18、果转录产生 cImRNA 和 cro mRNA，并分别编码产生 cI 蛋白和 Cro 蛋白。CI 蛋白是一种DNA 阻遏物，它同 Cro 蛋白一样能结合操纵基因 OL 和OR，阻止 OL 和OR的转录。OR是右向转录的关键性操纵基因，它决定着噬菌体是进入裂解生长，还是进入溶原化状态。在 OR中有 3 个阻遏蛋白的结合位点，分别称为OR1、OR2 和 OR3。OR1、OR3 分别与 PR和 PRM相邻接，cro 蛋白大多与 OR3 结合，CI蛋白主要结合于 OR1 和 OR2。由于 CI 蛋白同 OL和 OR的结合，阻止了从 OL和 OR的起始转录，因而导致左向基因 C 和右向基因 C以及 cr

19、o 的转录被 CI 蛋白所阻遏。这样一来，基因 c和 c就不再编码对启动子 PRE行使正调节作用的蛋白产物，使基因 cI 依赖于 PRE 启动转录也随之被阻遏，但通过 CI 蛋白结合 OR1和 OR2，抑制了 cro 基因转录以及 Cro 蛋白的合成，结果导致 CI 阻遏蛋白维持启动子 PRM被激活，使 CI 蛋白能得以持续合成。噬菌体裂解生长与溶原化的建立取决于两种阻遏蛋白 CI 和 Cro 的合成。当 CI 蛋白的合成占优势时，PRM被激活，CI 蛋白继续起始合成，因而溶原化状态建立。相反 Cro 蛋白合成占优势，则 PRM被抑制，没有 CI 蛋白的合成，于是噬菌体在 Cro 蛋白的控制下

20、进入裂解生长。噬菌体基因组的整合 当 CI 蛋白比 Cro 蛋白的合成占优势而引起溶原化状态建立后，DNA 既不能进行复制，也不能进行滚环复制，而是插入到宿主细胞染色体 DNA 上，并且随着宿主 DNA 的复制平均的分配到子代细胞中去。由于在噬菌体感染的早期，c和 c蛋白的合成，不仅导致 CI 蛋白产生，而且也激活了基因 int所依赖的 Pi 启动子的转录，编码产生整合酶。当噬菌体处于溶原化状态时，尽管 CI 蛋白抑制了左向和右向大多数基因的转录，但因 Pi 对 CI 蛋白的作用不敏感，所以基因 int 仍能够产生低水平的表达。基因 int 编码的整合酶能识别细菌附着位点和噬菌体附着位点。at

21、tB 位于宿主基因 gal 和 bio 之间，由 25bp组成，attP 长约 240bp。在 attB 和 attP 的位点上都含有相同的核心序列，称为 O 区，该区由 15bp 组成：5GCTTTTTTATACTAA3 3CGAAAAAATATGATT5 噬菌体的 attP 由 P、O、P3 个序列构成，大肠杆菌的 attB 则包含 B、O、B3 个序列组分，attP 和 attB 除了在 O 区的序列完全一致外，P、P、B、B各个序列之间是完全不同的，O 区是 attP 和 attB 发生重组的位点，这一重组过程需要整合酶催化，但整合酶必须首先与宿主编码的宿主整合因子结合形成复合体，才能

22、催化attP 和 attB 在 O 区进行重组而形成原噬菌体。在原噬菌体的左边是attL（BOP），右边是attR（POB），其整合反应可写成：BOB+POP BOP+POB Int Hif 细菌 噬菌体 原噬菌体 经过二者的重组作用，噬菌体基因组被插入到宿主的染色体 DNA 上，整合后的原噬菌体基因组排列顺序也由裂解生长时的 A-J-N-CI-R 转变为 N-CI-R-A-J。进入溶原化的原噬菌体往往只产生 CI 蛋白的合成，并以此来维持噬菌体的溶原状态。然而，CI 蛋白的合成表现为自我调节，当 CI 蛋白浓度低时，他催化启动子 PRM的活性以维持产生 CI 蛋白。而当 CI 蛋白浓度过高时

23、又会抑制PRM的转录作用。原噬菌体的割离 噬菌体基因组被整合到细菌染色体 DNA 上的作用是可逆的，当 CI 蛋白的作用受到抑制时，被整合的原噬菌体经过切割，其 DNA 又可离开细菌染色体而游离出来，恢复他的裂解性生长。这一作用要求基因 int、xis 以及宿主编码的 Hif 蛋白的参与。由于整合酶在噬菌体整合过程中的两个作用底物是噬菌体DNA 和细菌 DNA 的附着位点，即 BOB和 POP位点，整合酶只能催化 BOB和POP之间的交换重组。然而，原噬菌体切割是整合过程的逆反应，其作用的底物则是 attP 和 attB 重组后产生的 BOP和 POB，这一切割过程不仅需要整合酶，Hif，而且

24、还需要另一个邻近 int 的 xis 基因的作用。通过基因 xis 编码产生的切割酶与整合酶结合构成复合体，该复合体具有结合 BOP和 POB的能力，并且可以促使二者进行相互交换和重组，结果导致重新形成游离的环状DNA 分子。原噬菌体基因组的切割反应还可能与宿主编码的一种反向刺激因子（factor for inversion stimulation,FIS）有关，FIS 在 POB上的特异结合位点与 Xis 的结合位点是重叠的，并且能够同 Xis 一起结合到这个位点上,当Xis 蛋白浓度适宜时，FIS 能够提高切割重组 20 倍。但在 Xis 蛋白浓度处于饱和状态下，FIS 不起作用，而当 F

25、IS 浓度过高时，则可产生非特异性的结合，阻止切割反应。然而应该指出的是，基因 xis 是通过启动子 PL 进行转录的，而 PL 在溶原状态下受到了 CI 蛋白的阻遏，结果使基因 xis 不能表达。但一些诱变因子如紫外线辐射，丝裂霉素对宿主 DNA 造成的损伤，可激活一个 SOS 修复系统。这个修复系统含有大约 20 个基因，其中研究的最为清楚的是基因 recA 和 LexA。SOS 系统在大肠杆菌细胞处于正常情况下是关闭的，这一修复系统的关闭是通过基因 LexA 蛋白的功能来实现的，LexA 蛋白是一种阻遏蛋白，它的活性可受到基因 recA 产物的调节。recA 蛋白具有 3 种主要的生物活

26、性：一是重组活性，二是单链 DNA 结合活性，三是蛋白酶活性，它在正常细胞内是行使同源重组的功能，而当 DNA 出现损伤时，recA 蛋白可结合于 DNA 因损伤而产生的单链区域，并且以一种蛋白酶的活性形式作用于 LexA 蛋白 Ala-Gly 之间的肽键，使之水解失活。同样 recA 蛋白酶在溶原菌中也可水解 CI 阻遏蛋白，随着 CI 阻遏蛋白的生物活性丧失，基因 Xis 以及其他与裂解生长有关的基因不再受到抑制，于是噬菌体结束溶原周期而进入裂解周期，引起宿主细胞的裂解。除此而外，一些 cI 基因温度敏感的突变株，当他们处于温度为 30到32的条件下，基因 cI 能进行正常表达，合成 CI

27、 蛋白。而一旦温度上升到42时，cI 基因不能再编码合成 CI 蛋白，原噬菌体基因组也会从宿主染色体DNA 上切割下来，并释放到细胞内，重新恢复裂解生长。当一个溶原的 Hfr 细胞与一个非溶原的 F-细胞结合时，也能产生结合子诱导，此时原噬菌体因被引入到一个无 CI 阻遏蛋白的 F-细胞中也会发生割离。裂解性-溶原性选择决定 在噬菌体感染宿主细菌 1015 分钟后就要做出裂解性-溶原性选择决定。人们认为细胞生理学状态影响这个选择决定的结果，但是详细机制还不清楚。正如前面所提到的，这种选择决定依赖于激活蛋白C的水平。如果C水平高，则 C指导 CI 阻遏物的高水平表达，被感染的细胞则进入溶原性途径

28、。如果 C不存在或水平低，则细胞进入裂解性途径。似乎有几种不同的因子控制着 C的水平。第一，C不稳定，它可以被细菌的蛋白酶 HflB 或 FtsH 降解。由于 FtsH 是一种膜结合蛋白，其生化分析一直是难题。似乎是由细胞生理学状态调节 FtsH 活性的。已经知道细胞饥饿、在贫瘠的培养基中生长、在低温下生长等都有利于形成溶原性状态，但是这些影响因子与C水平之间关系的机理还不清楚。第二，FtsH 活性还可能被第二种噬菌体蛋白C调节，它显然是充当HflB 的竞争性抑制剂。因此高水平的C可以稳定C。第三，PL和 PR启动子分别控制 C和 C的表达。因此他们是在感染过程中的早期得到表达的。被几个噬菌体

29、同时感染的细胞更有可能进入溶原性途径，对此人们认为是由于基因剂量效应引起的。基因剂量效应导致了较高水平的 C和 C表达。第四，其他的细胞蛋白明显地影响着裂解性-溶原性选择决定的结果。突变hflK、hflC或 hflD也导致高频率的溶原化。HflKC 复合体也是膜结合蛋白。相反的 lon 突变（编码一种非特异性的依赖 ATP 的蛋白酶）或 crp 突变（编码激活蛋白 CRP 或称 CAP），都能关闭溶原性应答。这些突变体影响裂解性-溶原性选择决定的机制还了解甚少。参考文献：1.分子病毒学徐耀先、周晓峰等编著.湖北科学技术出版社 2000 2.噬菌体-在致病机理及生物技术中的作用美.沃尔德、.弗里

30、德曼、.阿迪亚 主编.艾云灿、孟繁梅 主译.2007 3.Molecular Biology of the Gene,6th Ed.,&,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2008 4.Lewin B.著,余龙等译 基因.科学出版社，2005，北京 5.lan B.D.et.al.Revisited gene regulation in bacteriophage.Curr.Opin.Genet.Dev.15:145-152 6.Max G.Bacteriophage:The Untold Story.J.Mol.Biol.1999,293:177-180

31、 7.Donald L.C.et.al.A new look at Bacteriophage genetic networks.J.Bacteriol 2007,189(2):298 304 8.Harrison E.Establishment and Maintenance of Repression by Bacteriophage Lambda:the role of the cI,cII and cIII proteins.Proc.Nat.Acad.Sci.USA,1971,68:2190-2194 9.Ronald A.A.et.al.How Cro and lambda-repressor distinguish between operators:the structural basis underlying a genetic switch.Proc.Nat.Acad.Sci.USA.1998,95:3431-3436 10.部分图片来自谷歌