高效液相色谱法分离和测定小麦中的5种内源激素

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1、高效液相色谱法分离和测定小麦中的5种内源激素张玉琼;仲延龙;高翠云;董召荣;陈娜;王梅方【摘要】 A high performance liquid chromatographic (HPLC) method was developed to determine the five endogenous hormones including indole- 3-acetic acid (IAA),abscisic acid (ABA),gibberellic acid (GA3),zeatin (ZT) and salicylic acid (SA) in wheat.The separatio

2、n conditions were optimized,and methanol was chosen as the extraction solvent.Then the extract was extracted by petroleum ether and ethyl acetate,and purified with the Sep- Pak C18 column.The chromatographic conditions were as follows:Eclipse XDB- C18 reversed phase column (250 mm x4.6 mm,5 ”m) ,the

3、 flow rate of1 mL/mi n,the injec tion volume of 10 “L,and the detection waveleng th of240 nm were used for the separation of SA from 14.5 min to 18 min,while the detection at 254 nm used for the separation of the others.Methanol (A) and acetic acid aqueous solution (pH 3.6) (B) were used as the mobi

4、le phases with the linear gradient set as follows:0-7 min20A,7-10 min 20 A-28 A,10-17 min 28 A,17-19min 28 A-40 A,19-35 min 40 A.The results showed that:the hormones were separated well with the recoveries of 96. 9-98, and the RSDs were in the range of 1.54 to 2.29.It is a reliable method for rapid,

5、accurate separation and determination of the endogenous hormones in wheat.%建立了高效液相色谱法(HPLC)用于分离和测定小麦中的吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)、玉米素(ZT)和水杨酸 (SA) 5种植物内源激素.经过条件优化,选用甲醇作为样品提取溶剂.然后,经石油醚和 乙酸乙酯萃取，经Sep-Pak C18小柱纯化.液相色谱的分离采用Eclipse XDB-C18(250 mm x4.6 mm,5pm)反相色谱柱；流速为1 mL/min ;进样量10pL.检 测器波长设置为254 nm; 14.

6、5 min时切换到240 nm; SA洗脱后即18min时切 换回254 nm.流动相A为甲醇,B为乙酸溶液(pH 3.6)梯度条件为07 min,20% A;710 min,20%A 28%A ;1017 min,28%A ; 17 - 19 min,28% A 40% A; 19 35 min,40%A结果表明，小麦中各激素的分离效果理想，加标回收率 达96.9% 98%相对标准偏差在1.54% 2.29%之间因此，该方法的建立为快 速、准确地分离和测定小麦内源激素提供了可靠的方法.期刊名称】色谱年(卷),期】2013(031)008【总页数】4页(P800-803) 【关键词】 高效液相

7、色谱法;内源激素;小麦【作 者】 张玉琼;仲延龙;高翠云;董召荣;陈娜;王梅方【作者单位】 安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥230036;安徽农业大学生命科 学学院,安徽合肥230036;安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥230036;安徽农业 大学农学院,安徽合肥230036;安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥230036;安徽 农业大学生命科学学院,安徽合肥230036【正文语种】 中文【中图分类】 O658植物激素对植物的种子萌发、生长、开花、成熟、衰老、休眠等生命活动起直接或间接的调节、控制作用1，2。小麦是我国三大农作物之一，如何调控其生长 发育，进而促进分蘖，提高产量和品质，备受

8、农业科研人员的关注。了解小麦内源 激素的变化规律，对于研究其产量和抗性等具有重要的生产实践价值3-5。 植物内源激素含量的测定方法主要有酶联免疫、同位素标记和高效液相色谱等。其 中高效液相色谱法具有重现性好、分辨率和灵敏度高、分析速度快等优点，近几年 应用逐渐增多6-8；其中各种激素分别检测较多9，10，虽然效果好，但 耗时较长。为了快速分离、检测植物中的多种内源激素，应优先考虑多种激素的同 时检测。内源激素在体内含量甚微，种类复杂，结构各异，对温度等条件敏感11。如吲哚乙酸（IAA ）和玉米素（ZT ）属于生物碱，赤霉素（GA3 ）和脱 落酸（ABA ）是萜类化合物，水杨酸（SA ）属于酚酸

9、类，使用HPLC同时检测， 难以实现每种物质都很好分离的效果12。因此有必要对 HPLC 方法进行优化 同时，选择合适的提取方法也是关键13。恰当的预处理有利于激素的富集和 干扰物质的去除。目前，关于小麦内源激素的提取、分离、测定方法相对较少。尤 其近年来被认为是一种新的植物激素的物质水杨酸（SA）14 的高效液相 色谱法测定鲜有报道。本实验从洗脱液梯度、pH和检测波长的切换等方面对激素 分离条件进行优化，对小麦中的IAA、ABA、GA3、ZT、SA进行分离和测定，建 立一种分析小麦激素的有效方法，从而为小麦内源激素调节和控制小麦的生长、衰 老等研究提供关键技术。1 实验部分1.1 仪器与试剂

10、Agilent 1200高效液相色谱仪， Agilent 1200系列泵，可变波长检测器，TU1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），RE-52A旋转 蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），320-S pH计（Mettler Toledo ）, HR-120电 子天平（A&D公司），KQ500DE型超声波脱气，Beckman Allegra 64R冷冻离 心机。玉米素、赤霉素、生长素、脱落酸、水杨酸标准品（Sigma公司，纯度99%）, 甲醇、乙酸（色谱级，美国Tedia公司），石油醚、乙酸乙酯（分析纯，国药集 团化学试剂有限公司），实验用水为超纯水。所有试剂在使用前均用0.45p

11、m微 孔滤膜过滤。1.2 标准溶液的配制用甲醇配制0.2 g/L生长素、0.1 g/L玉米素、0.1 g/L脱落酸、2.5 g/L赤霉 素、0.4 g/L水杨酸的混合标准溶液。1.3 样品前处理按参考文献15 的样品处理方法并予以改进和优化。称取新鲜小麦叶2 g、根5 g，分别加入10 mL预冷的80% （如无特殊说明均为体积分数）甲醇，冰浴研磨 成浆，保鲜膜密封后于4工冷浸过夜。然后于4工条件下以8000 r / min离心10 min得上清液，残渣加入8 mL80%的冷甲醇离心10 min后合并上清液。全部滤 液于40工下减压浓缩至原体积的1/3,加入30 mL石油醚萃取脱色3次，弃醚 相

12、。水相用20 mL乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，40C下减压蒸干。加入pH3.5 的乙酸溶液2 mL,过Sep-Pak C18小柱纯化，用甲醇洗脱，收集后在40C下减 压浓缩至干。用流动相溶解并定容至2 mL,经0.45pm微孔滤膜过滤后进行 HPLC分析。1.4 色谱条件色谱柱为 Eclipse XDB-C18 （ 250 mmx4.6 mm,5pm, Agilent公司），流动 相A为甲醇，B为乙酸的水溶液（pH3.6 ），梯度条件为07 min 20%A , 7 10 min 20%A 28%A ,10-17 min 28%A ,17-19 min 28%A40%A , 19-35 min

13、 40%A。流速为1 mL/min，进样量为10pL。检测器波长设置为 254 nm ; 14.5 min时切换到240 nm ; SA洗脱后即18 min时切换回254 nm。 检测温度为室温。2 结果与讨论2.1 样品处理条件的优化 在小麦生长发育过程中，植物内源激素含量甚微，且与其他各类物质并存，应用 HPLC检测时，不可避免地相互干扰，呈现分离效果差等现象。因此，如何有效减 少杂质是激素提取的关键。分别以水、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚作为溶剂，发现甲 醇的提取率高、杂质较少。采用甲醇为提取溶剂，分别设置浸提时间为8、12、16、20、24 h。小麦中玉米素、水杨酸和赤霉素等激素的提取效率随

14、提取时间的 延长而升高，16 h以后达到较高水平，再延长时间增加不明显。经石油醚脱色和 乙酸乙酯萃取后，杂质的干扰依然较大，因此选择进一步纯化处理。参照文献15,16 的样品处理方法，过聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP ）柱、Sep-Pak C18 小柱进行纯化，结果发现检测不出水杨酸。由于水杨酸含量低且易被 PVPP 吸附， 因此选择过Sep-Pak C18小柱纯化。实验结果表明，5种激素提取效果良好。2.2 色谱条件的选择2.2.1 流动相梯度以甲醇（A）-水（B）两相作为流动相，选择不同比例的流动相对激素进行分离。 用等度洗脱进行最适条件摸索，分别设定甲醇（A相）为15%、17%、20%、 2

15、3%、 26%、 28%、 35%、 40%。结果发现当甲醇含量高于20%时，玉米素在 23 min洗脱出来，容易与样品中的杂质峰重叠；而甲醇含量低于20%时，出峰 时间过晚，检测时间变长；甲醇含量为 20%时，其他激素峰拖尾严重。经过优化， 发现当甲醇含量上升到28%时，GA3和SA的分离度高；当升高到40%时，IAA 和 ABA 的分离效果好。综合考虑各激素分离度、峰形的对称性以及缩短分析时间， 最终采用1.4节所述的梯度洗脱条件。2.2.2流动相的pH 乙酸可以抑制样品的解离，改善峰拖尾现象，因此在流动相中加入乙酸。不同浓度 的乙酸对样品的分离也有较大影响。分别用pH3.0、3.2、3.

16、4、3.6、3.8、4.0 的 乙酸溶液进行试验。结果显示当pH v 3.6时，出峰时间过早，易于与样品中的杂 质峰重叠，干扰实验结果。当pH提高时，各激素保留时间也相应变长。而当 pH3.8时，赤霉素与水杨酸峰部分重叠。当pH达到4.0时各激素的保留时间延长， 检测时间也相应增加。因此，选择pH3.6的乙酸的水溶液为流动相B，各峰的分 离度以及保留时间都较好。2.2.3 检测波长在190-400 nm范围内，用紫外可见分光光度计扫描混合标准溶液。各激素的最 大吸收波长分别为：IAA , 250 nm ; ABA , 246 nm ; GA3 , 210、255 nm;ZT, 262 nm;S

17、A, 240 nm。参照文献17 方法，在254 nm波长下对激素的标准 品及样品进行测定并在GA3出峰前将检测波长切换到210 nm （ GA3的最大吸收 波长）。结果发现，由于210 nm与甲醇的最大吸收波长接近，GA3峰形较差； 而254 nm虽然不是GA3的最大吸收波长，但是在此波长下其吸收值较高，而且 可以有效避免与流动相的干扰。因此首先以254 nm作为激素的检测波长，在此 波长下SA的响应值低、峰形差（图1a）。而切换波长更利于待测组分的分析检 测，因此选择在SA出峰前（14.5 min ）将检测器波长切换到240 nm，待出峰完 全结束后（18 min ）切回254 nm （图

18、1b）。2.2.4 流速图1在（a） 254 nm和（b）切换波长检测条件下的小麦叶色谱图Fig.1Chromatograms of wheat leaf samples under（a）254 nm and（b） switching UV wavelengthsPeaks：1.zeatin（ZT）;2.gibberellic acid（GA3）;3.salicylic acid（SA）;4.indole-3-acetic acid（IAA）;5.abscisic acid（ABA）.分别考察了流速为0.6、0.8、1.0、1.2和1.5 mL/min时的分离效果。当流速小 于1 mL/min

19、,检测时间延长；当流速为1.2或1.5 mL / min，赤霉素和水杨酸 的色谱峰重叠，分离效果差。流速为1 mL/min时，各激素能在35 min内很好 的分离。在优化的色谱条件下，对混合的标准样品进行检测。从图2中可以看出， 5种激素 能够较好地分离和检出。图2混合激素标准品的色谱图Fig.2 Chromatogram of the mixture of hormones standardsPeaks：1.ZT；2.GA3；3.SA；4.IAA；5.ABA.2.3 标准曲线及其线性范围 以5种激素的标准溶液为原液进行逐级稀释，在优化的色谱条件下分析。以峰面 积为纵坐标（y）,质量浓度为横坐

20、标（x,mg/L）,计算各内源激素的回归方 程、相关系数和线性范围，同时按3倍信噪比得到各激素检出限（见表1）。由结 果可知,标准品浓度与峰面积的相关性良好。表1 5种激素的线性关系和检出限Table 1 Linear relationships and LODs of the hormonesHormone Regression equation Correlation coefficient Linear range/（mg/L） LOD /（mg/L）ZT y二 51.40x + 0.58970.99990.39125.00.195 GA3y = 44.65x + 2.8170.9994

21、0.488-62.50.208 SA y = 29.34x- 5.5750.99941.95-31.30.976 IAA y 二 39.03x + 16.370.99890.391-12.50.300 ABA y 二 64.24x + 6.9330.99960.318-4.680.1952.4 回收率的测定和实际样品分析取小麦根样品2 g，按照1.3节方法制备样品并用上述条件进行测定。如图3所示， 小麦根中的激素能得到很好的分离。随后进行加标回收试验,结果见表2。图 3 小麦根样品的色谱图 Fig.3 Chromatogram of wheat root samplePeaksare the

22、same as in Fig.2.表 2 各激素的加标回收率（n 二 5） Table 2 Spiked recoveries of the hormones(n = 5) HormoneSample content /( mg / L ) Added /( mg / L ) Meanrecovery%RSD%ZT 1.52 5.0 98.0 1.89 GA3 7.60 10 97.8 1.65 SA 4.95 5.0 97.8 1.93 IAA 5.18 10 96.9 2.29 ABA 1.10 5.0 97.6 1.54测定孕穗期小麦样品中的激素含量，结果显示小麦叶中含玉米素0.962p

23、g/g、赤 霉素 2.54pg/g、水杨酸 2.80pg/g、生长素 0.523pg/g、脱落酸 0.736pg/g。 小麦根中含玉米素1.10pg/g、赤霉素1.36pg/g、水杨酸0.480pg/g、生长 素 0.377pg/g、脱落酸 0.503pg/g。3结论 通过优化小麦中5种内源激素的提取条件以及色谱条件，建立了一种简单、有效 的高效液相色谱分析方法。分离效果理想，加标回收率达96%98%，检出限为 0.195-0.976 mg /L。方法满足激素定量分析的测定要求，为进一步检测小麦生 长过程中内源激素的变化、激素代谢与小麦的生长、衰老等相关性研究提供了关键 技术。参考文献：1 M

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