基因工程与胚胎工程

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1、基因工程一、基因工程(DNA重组技术)概述： 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的 设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术， 赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符 合人们需要的新的生物类型和生物产品。二、目的基因的获取：1. 概念：指编码蛋白质的结构基因；2, 获取方法：(1) 从基因文库中获取： 概念：将含有某种生物不同基因的许多 DNA片段，导入受体菌群体中储存，各 受体菌分别含有这种生物的不同基因； 种类：基因组文库、部分基因文库；(2) 利用PCR技术扩增： 概念：一项在生物体外复制特定DNA片 段的核酸合成技术； 原理：DNA双链复制； 前提：模版DNA、引物、dNTP、Taq

2、酶； 过程：A. 加热至9095C，DNA解链；B. 冷却至5560C，引物结合互补DNA链；C. 加热至7075C，Taq酶从引物起始进行 互补链的合成；D. 以指数形式扩增形成新的DNA分子；(3 ) 人工合成法：如果目的基因较小， 其核苷酸序列又已知，可以通过DNA 合成仪用化学方法直接人工合成；三、基因表达载体的构建(核心步骤)：1. 种类：质粒、久噬菌体、动植物病毒；2. 表达载体的组成：目的基因、启动子、 终止子、复制原点、标记基因；(1) 启动子：位于基因首端，是RNA聚 合酶识别、结合的部位，驱动基因 转录出mRNA；(2) 终止子：位于基因尾端，终止转录;(3) 标记基因：用

3、于鉴别受体细胞中是 否含有目的基因；3. 功能：使目的基因在受体细胞中稳定存 在并遗传给下一代，使其得以表达；4. 特点：(1) 具有多个限制酶的切割位点(便于 与外源目的基因连接)；(2 ) 能够在宿主细胞中大量复制并稳定 保存(提供大量目的基因)；(3) 具有特殊的标记基因(用于判断目 的基因是否导入受体细胞)；(4 ) 载体及目的基因不被破坏(使得目 的基因顺利表达并被检测)；四、目的基因导入受体细胞：1, 转化的概念：目的基因进入受体细胞并 在受体细胞内维持稳定和表达的过程；2, 目的基因导入植物细胞：(1 ) 农杆菌转化法： 特点:农杆菌易感染双子叶和裸子植物; 过程：A, 目的基因

4、插入农杆菌Ti质粒T-DNA上；B, 含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌；C, 含重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞;D, Ti质粒上的T-DNA转移至受体细胞，并 整合到受体细胞的染色体DNA上；E, 培养再生植株，检测是否表现出新性状;(2) 其他：基因枪法、花粉管通道法；3, 目的基因导入动物细胞：(1) 方法：显微注射技术；(2) 过程： 分离纯化目的基因的表达载体； 采用显微注射仪注射雌性动物卵细胞； 含目的基因的受精卵经早期胚胎培养； 移植胚胎到雌性动物输卵管或子宫内；4, 目的基因导入微生物细胞：(1) 原核生物特点：繁殖快，多为单细 胞生物，遗传物质相对较少；(2) 过程： 用C

5、a2+处理细胞，使其处于能吸收周围 环境中DNA分子的生理状态(感受态); 重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与 感受态细胞混合，一定温度下完成转化;五、目的基因的检测和鉴定：1. 检测转基因生物染色体DNA上是否插入 了目的基因一一DNA分子杂交技术；2. 检测目的基因是否转录mRNA 分子 杂交技术；3. 检测目的基因是否翻译成蛋白质一一抗 原一抗体杂交；4. 检测目的基因是否赋予生物新性状 个体生物学水平的鉴定。胚胎工程一、体内受精过程：1. 精子的发生：(1) 时期：初情期至生殖机能衰退；(2 ) 场所：睾丸的曲细精管；(3) 过程： 精原细胞进行多次有丝分裂； 初级精母细胞进行减数第

6、一次分裂； 次级精母细胞进行减数第二次分裂； 精子细胞经变形后形成精子；(4) 精子的发育： 形态：形似蝌蚪，分为头、颈、尾； 变形过程：A. 细胞核成为精子头的主要部分；B. 高尔基体发育成为精子头部的顶体；C. 中心体发育成为精子的尾；D. 线粒体变成精子尾基部的线粒体鞘；E. 细胞质浓缩成为原生质滴(最后脱落)；2. 卵子的发生：(1) 时期：胚胎性别分化之后；(2) 场所：卵巢(MI)、输卵管(MII)；(3) 过程： 卵原细胞进行多次有丝分裂； 初级卵母细胞排卵前后完成M I； 次级卵母细胞在受精过程中完成MII； 次级卵母细胞分裂为卵子和第二极体；(4) 排卵： 概念：卵子从卵泡中

7、排出； 特点：一个卵泡只排出一个卵原细胞；3. 受精作用：(1 ) 概念：精子与卵子结合形成受精卵;(2) 标志： 受精：卵黄膜和透明带间隙有两个极体; 受精完成：雌雄原核融合；(3) 过程： 精子在雌性动物生殖道内获能；卵子在 输卵管中达到减数第二次分裂中期； 精卵相遇，发生顶体反应释放顶体酶； 卵丘细胞溶解，精子接触透明带； 透明带溶解，精子接触卵黄膜； 发生透明带反应，精子被微绒毛抱合； 精子入卵，发生卵黄膜封闭作用； 雄原核与雌原核融合，形成受精卵；(4) 精子入卵后两者形态变化： 精子尾部脱落，原核膜破裂，新核膜形 成，精子核体积变大，形成雄原核； 卵子被激活，完成MII，排出第二极

8、体;二、早期胚胎发育：1, 卵裂期：细胞进行有丝分裂，数量增多；2, 桑椹胚：细胞数目达32个，属全能细胞；3, 囊胚：内细胞团将来发育成胎儿的各种 组织，滋养层将来发育成胎膜和胎盘， 胚胎内部出现含有液体的囊胚腔；4, 原肠胚：内细胞团表层细胞形成外胚层， 下方细胞形成内胚层，包围形成原肠腔;三、体外受精和早期胚胎培养：1. 卵母细胞的采集和培养：(1 ) 实验动物：促性腺激素处理后冲取;(2) 大型动物：从母畜卵巢中吸取；2. 精子的采集和培养：(1) 采集：假阴道法、手握法、电激法;(2 ) 获能：培养法、化学诱导法；3. 受精过程：获能溶液或受精溶液中；4. 胚胎早期培养：(1 ) 培

9、养液：无机盐和有机盐类、维生素、氨基酸、核苷酸、激素、血清;(2) 胚胎移植时期：一般为桑椹胚或囊 胚阶段(人则在816个细胞阶段);四、胚胎工程应用：1, 胚胎移植：(1 ) 生理基础： 同种动物的供、受体排卵后的生理变化 同期(为胚胎移入提供相同生理环境); 早期胚胎在一定时间内处于游离状态(为胚胎的收集提供了可能)； 受体子宫对外来胚胎不发生免疫排斥反 应(为胚胎的存活提供了可能)； 胚胎与受体子宫可建立正常的生理和组 织联系(为胚胎后续发育提供了保障);(2) 优势：充分发挥雌性个体繁殖潜力；2, 胚胎分割：(1 ) 时期：桑椹胚或囊胚时期；(2 ) 分割：对囊胚的内细胞团均等分割；3, 胚胎干细胞：(1 ) 来源：分离自早期胚胎或原始性腺;(2 ) 特点：体积小，细胞核大，核仁明 显，具有发育的全能性。