各突变检测方法比较

《各突变检测方法比较》由会员分享，可在线阅读，更多相关《各突变检测方法比较（11页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、1、RNA 酶 A 切割法(RNase A cleavage)在一定条件下，氨基源双链核酸分子 RNA：RNA 或 RNA：DNA 中的错配碱基可被RNaseA切割，切割产物可通过变性凝胶电泳分离。当RNA探针上错配的碱基为嘌吟时， RNaseA在错配处的切割效率很低，甚至不切割，而当错配碱基为嘧啶时，则其切割效率较 高。故如果仅分析被检DNA的一个条链，突变检出率只有30%,如同时分析正义和反义二 条链，检出率可达70%。该法需要制备RNA探针，增加了操作的复杂性，但可用于l-2kb 的大片段进行检测，并能确定突变位点。于这些优越性，它仍被作为一种经典方法用于对未 知突变进行分析。电泳法（不

2、能确定突变位点，都要通过测序等解决）2、变性梯度凝胶电泳（ DGGE）双链 DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电 荷。不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样， 因此不能被区分。 DGGE/TGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿 素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的 DNA 片段区分开来。一个特定的 DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域（meltingdomain, MD）和解链 行为（melting behavior）。一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，

3、每个解链 区域有一段连续的碱基对组成。当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区域浓度时，该区 域这一段连续的碱基对发生解链。当浓度度再升高依次达到各其他解链区域浓度时，这些区 域也依次发生解链。直到变性剂浓度达到最高的解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解 链，从而双链 DNA 完全解链。如果不同 DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时， 这些片段就不能被区分开来。在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夹 子，一般 30-50 个碱基对）可以解决这个问题。含有 GC 夹子的 DNA 片段最高的解链区 域在GC夹子这一段序列处，它的解链浓度很高，可以防止DNA片段在DGGE胶中

4、完全 解链。当加了 GC 夹子后， DNA 片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开。3、PCR-SSCP法单链构象多态性单链构象多态性（single-strand conformation polymorphism, SSCP） 是一种分离核酸 的技术，可以分离相同长度但序列不同的核酸（性质类似于DGGE和TGGE，但方法不同）。实验步骤利用PCR从提取出的DNA中扩增16S rRNA基因。利用久-外切核酸酶消化掉一条链（其中一个 PCR引物被磷酸化，这条链将被去 除）。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。应用：单链构象多态性可用于预筛选克隆文库。可对其中的某一个条带进行测序，并与数据

5、库中已知序列比对。原理：单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即 使是一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构并引起在非变性电泳条件不同的电泳迁移 率。4、杂合双链分析法（HA）由突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一个凸起，在非变性胶中电泳时，会产生与相应的同源双链DNA不同的迁移率，从而使两者被分离开。该方法原理与单 链构象多态性(SSCP)相似,只不过SS-CP分离的是单链，而HA法分离的是双链。HA法简单 迅速，但只适用于200300pb的片段，且不能确定突变位置，检出率只有80%左右，有人建议 将HA法和SSCP法联合使用，可能将检出

6、率提高到接近100%，也有科研工作者建议使用缺失 的野生型等位基因来提高该方法的灵敏度。5、化学切割错配(CCM)化学切割错配是在Maxam-Gilbert测序的基础上发展起来的一项突变检测技术，在DNA : DNA或DNA : RNA异源杂合双链核酸分子中,错配的C能被羟胺(hydroxylamine)和 哌啶(piperidi ne)切割,错配的T能被四氧化锇(Osmiumtetroxide)所切割，切割产物跑变性胶 电泳即可确定是否存在突变。只要操作得当，不会发生非特异性切割，如果对正义链和反义链 都进行分析，可使检出率达到100%;使用荧光检测系统将会大大增强该方法的灵敏度，从而 可检

7、测出十个细胞中的一个突变细胞。该方法的最大优点是能对长至2kb的片段分析，并能 确定突变位置，缺点是步骤多，费时，且需接触有毒的化学物质。6、碳化二亚胺检测(Carbodiimide,CDI)与CCM法相似,CDI能够对错配的G和T进行修饰，当用标记的引物对CDI修饰过的双 链DNA进行DNA合成时，延伸会在修饰过的碱基处终止下来，合成产物跑变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳即可检测出是否有突变该方法的最大优点也是能对12kb的片段进行分析,突变检 出率达到100%，能确定突变位置，并且CDI是一种没有毒性的物质，有报道曾用该法检测出了 7.2kbDNA片段中的一个点突变，但当一个DNA片段中存在多个突

8、变时，该方法就不适用。7、酶促切割错配(EnzymeMismatchCleavage,EMC)EMC是一种与RNaseA切割相类似的方法。T4核酸内切酶 是一种分解酶(resolvase)，能够识别12种错配的碱基并在错配碱基的附 近进行切割，酶切产物跑变性胶或中性胶即可检测出是否有突变，电泳产物的检测可用放射 自显影，也可用银染。由于该法能对DNA : DNA异源杂合分子进行分析，因而省去了体外 转录的步骤，其最长检测片段可达到1.5kb，该法的缺点是存在非特异性切割现象，并且对 有些错配碱基的识别不是100%，因此在每次检测时都必须设有一个内对照。8、限制性片断长度多态性(restrict

9、ion fragment length polymorphism , RFLP)连琐 分析技术RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差 异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。RFLP 技术主要包括以下基本步骤：DNA提取用限制性内切酶酶切DNA用凝胶电泳分开DNA片段把DNA片段转 移到滤膜上-利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段(Southern杂交)和结果分 析。其检测特点是：具有较高的特异性，可以确定突变的部位及性质，重复性好。但不足之 处是仅适合于多态性的检测：即突变频率大于1%才能被检测到；因此， RF

10、LP 分析对于检 测突变的早期，尤其是在野生型远多于突变型时其敏感性就显得不足了。发展：反向限制性位点突变分析（iRSM）,进行低突变频率等位基因的检测。其方法 主要用于突变早期的检测，当某一野生型序列发生突变导致原有酶切位点（E1位点）的消 失，产生一新的酶切位点（E2位点），称之为E1-E2突变，但突变频率较低常规RFLP无 法检测。此时，用一内切酶（E1）对其进行酶切，这样可选择性地移去大部分的野生型序列 （99%）。无酶切位点的部分通过PCR扩增（引物被设计在E2位点的一侧），产物用另一 内切酶（E2）进行RFLP分析，根据产物中是否存在E2位点即可判断有无突变发生。由于该方法在RFL

11、P分析之前用另一种内切酶对靶序列进行消化,减少了野生型序列的 含量（一般消化率99%），因而大大提高了突变序列的检出率。值得注意的是：只要选择适 当的限制性酶切位点，此项技术适应于任何基因、突变或生物体。但是，由于聚合酶的关系， 可能在 PCR 扩增后导致 iRSM 分析出现假阳性。这可以通过使用高保真聚合酶进行修正； 同时为了提高检出率，iRSM分析可于其它分析技术联合使用或增加目的基因的含量。9、切割片段长度多态性（CleavageFrag-mentLengthPolymorphismCFLP）CFLP技术是在限制性酶切片段长度多态性（RELP）和SSCP基础上发展起来的一种基因 突变检测

12、技术，其原理是:双链DNA变性后形成的单链在中性条件下形成二级结构（包含多 个折叠的发夹状结构），正如SSCP 一样,这种二级结构取决于DNA的核苷酸组成和顺序，即使 有一个碱基的差异，也会形成不同数目的折叠状发夹结构，而Cleavasel外切酶能识别这种发 夹结构，并在该结构的附近进行切割，切割产物跑变性聚丙烯酰胺凝胶检测,突变的DNA将出 现与正常对照不同的酶切图谱。10、PCR-ELISA 结合微测序检测点突变（PCR-ELISA & mini-sequencing）新近有报道称：使用 PCR-ELISA 结合微测序检测到无临床症状且未经抗病毒药物治疗 的乙肝患者HBV基因的YMDD主题

13、突变区存在天然Lamivudine耐药基因。其检测原理如 下：探针结合区野生型HBV基因序列：5-739ATACGG744 A-3 ,针对突变区域设计 的探针，Wild-Probe: 5-ATA CGG-3； Val-Probe: 5- ATG TIG-（针对 741 742 位点突 变，743 位点设计摆动配对）；Ile-Probe: 5-ATATAG-3、5-ATA TCG-3 、5- ATATCG-3 （针对743位点突变）。变性的扩增产物与上述3种类型探针杂交后，再加入 含生物素-7-dATP、Taq酶和Mg2+等的微测序缓冲液55C温育。如果Val或Ile探针与靶DNA 完全匹配，探

14、针 3 末端延伸一个带标记的腺嘌呤。反之，不匹配时，探针 Tm 降低， 3 末端游离而不延伸标记的腺嘌呤。利用链酶亲和素酶标系统检测探针上标记的生物素，可判 断样品中是否存在点突变。而近期我们所进行的点突变检测是基于PCR-ELISA和杂交链稳定性的基础上发展起来 的，主要是利用野生型和突变型序列与探针结合后在Tm值上的差异进行检测。近年来随着新技术、新材料的不断涌现，已知基因单位点突变检测技术将会得到迅速的 发展，从而距离理想的突变扫描方法（即：对大片段DNA进行突变扫描，100%的检出率， 无假阳性或假阴性现象，不需复杂的设备、花费低、不需使用有害试剂和同位素、高效率、 耗时短。）越来越近

15、。11、变性高效液相色谱分析（denaturing high performance liquid chromatography DHPLC）优点：高通量检测、自动化程度高、灵敏度和特异性较高、检测 DNA 片段和长 度变动范围广、相对价廉等。在部分变性的条件下， 通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间的差异， 发现 DNA 突变。异源双链 DNA 与同源双链 DNA 的解链特性不同，在部分变性条件下，异源双 链因有错配区的存在而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同源双链，故先被洗脱 下来，在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。DHPLC 高度自动化，可以自动取样，检测每个样品只需要 8 分钟左右

16、。 DHPLC 与其他检测 DNA 突变方法的最大不同在于，它能够纯化 DNA 片断。当然，只能检测 杂合突变是 DHPLC 的不足之处，但是这可以利用混合的方法(即将纯合突变样品和 野生型样品混合)来解决。在很多的研究中，DHPLC色谱图有改变的样本经测序均显示DNA有变异；在我们的 前期工作中曾用该方法检测了大量样本，特异性及敏感性均接近100%，提示该方法是一种 高效、可靠的突变检测方法。该方法的不足之处是无法得出具体的突变位点及突变类型， 还需DNA测序方法证实。12、DNA 测序(Sequencing)由各种突变检测技术检测到的突变最后都得由测序来确定突变类型及突变位置,而且测 序法

17、检测突变的效率达到 100%。但缺点是花费昂贵,所以对一些较大的,外显子较多的基因 不宜用测序法直接检测突变,同时也不适用于临床对大量的标本进行检测,此外,测序也不能 被当成是突变检测的金标准,杂合突变、胶压缩、 GC 富集区的存在等问题使得很难通过一次 测序获得精确的数据。Sanger法测序：利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入 一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四 种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于 ddNTP缺乏延伸所需要的3-0H基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地

18、在G、A、T或C处终 止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整， 使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的 的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶 片放射自显影或非同位素标记进行检测。13、双脱氧指纹图谱法(DideoxyFinger-printing,ddF)由于SSCP检测方法的灵敏度受到电泳温度、PCR片段大小等因素的影响,而直接DNA 测序的方法又费时、费钱，因此有研究工作者在实际应用中将SSCP和San ger双脱氧测序 法结合起来形成一种新的突变检测方法,即

19、 ddF。该方法的基因原理是:将PCR产物回收纯化后用两个引物分别做San ger双脱氧测序反 应,但不同的是仅加入一种双脱氧终止剂 ,反应产物跑中性聚丙烯酰胺凝胶电泳如果确有突 变的话,在病人的电泳图谱上将会丢失或获得一条带或者至少有一条带的迁移率会发生改 变。在ddF方法中,DNA链的迁移率不仅取决于其二级结构，而且与其大小相关，因而较SS-CP 法更为灵敏。MartincicD等曾经将SSCP法和ddF法进行了比较，发现ddF能将10种已知的 p53抑瘤基因突变全部检测出来，而SSCP法只能检测到10种突变中的6种。ddF法的灵敏 度不受电泳温度的影响，所能检测到10种突变中的6种。dd

20、F法的灵敏度不受电泳温度的影 响，所能检测的PCR产物长度也能达到近500bp，并且该法还能对突变位置进行相对定位。该 法的主要缺点是需要使用同位素,同时对回收的PCR产物纯度要求较高，非特异的PCR产物 将严重影响到最后结果的分析。14、寡核昔酸连接分析法(oligonucleotide ligation assay, OLA)该技术使用1对标记的探针，其中1条探针3端包含等位基因特异性碱基。先用PCR 扩增包含HPA基因SNP位点的基因片段，然后探针和扩增的等位基因片段互补结合，在 DNA 连接酶的作用下， 2 条探针连接形成一个双标记的产物。这个双标记产物的一端连于 固相表面，另一端的标

21、记物作为指示物，可以用ELISA方法检测。该法快速、可靠，可以 用于大量样本的基因分型，但是OLA法也需要一些PCR后的操作，需要序列特异性探针。15、熔解曲线分析法：染料法和FRET法基于荧光共振能量转移(FRET)原理的熔解曲线分析法是罗氏公司的专利技术。FRET 法使用2个探针，一条探针横跨HPA(血小板特异性抗原)的SNP位点，称为检测探针。 另一条探针与第一条探针相距15个碱基称为锚定探针。两条探针互相邻近的3端和5端 分别标记上荧光物质FITC和LightCycler Red 640。在PCR过程中，两条探针和扩增产物 结合，荧光物质 FITC 和 LightCycler Red

22、640 相互靠近。 FITC 受激发产生荧光，又激发 Red640,使其发出波长为640的荧光，通过检测器检测荧光信号。在PCR反应后，降低 体系温度到探针退火的温度以下，然后缓慢提高温度，检测探针发生解链从模板脱离，产生 1个熔解曲线。如果检测探针和靶基因完全互补，将会产生一个较高的解链温度Tm)，如 果发生错配将会产生1个较低的Tm,依据Tm的不同而将其分离。但该方法需要特殊的仪器LightCycler荧光定量PCR仪。除了使用FRET技术之外， 还可以使用DNA荧光染料作为荧光的来源，通过扩增子或未标记探针的熔解分析法来进行 基因分型。Liew等使用该法对HPA进行了基因分型并和FRET

23、探针法进行比较，发现这2 种方法的一致性达98.8%。Liew等进一步的研究表明，使用扩增子的熔解分析法在分析长 片段的扩增子时，存在一定的错误率，而使用未标记探针的结果则是完全准确的。这种点突 变分析技术的特点是简单、快速、自动化程度较高，易于推广。基于荧光染料的熔解分析法 无需价格昂贵的荧光标记的双杂交探针，而且每一个反应体系可以同时鉴定HPA两个系统 的等位基因，比FRET探针法更有优势。但是其需要特殊的熔解分析仪以及一种特殊的DNA 荧光染料。16、PyrosequencingPyrosequencing是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量的、精确和重复性好的 分析的技术。第一步

24、一测序引物和PCR扩增的、单链的DNA模板杂交，与酶一DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)、三磷酸腺苷双磷 酸酶(apyrase)和底物一adenosine 5 phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)孵育。第二步四种dNTP (dATPS，dTTP，dCTP，dGTP)之一被加入反应体系，如与 模板配对(AT, CG)，此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团(PPi) 释放出来。注意：反应时 deoxyadenosine alfa-thio triphos

25、phate (dATPS)是 dATP 的替代物，因 为DNA聚合酶对dATPS的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATPS不是荧光素酶的 底物。Polymerase+ dTPf PPI第三步一ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP, ATP驱动荧光素 酶介导的荧光素向氧化荧光素(oxyluciferin)的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的 可见光信号。ATP sulfurylasePPi+APS ATPLuciferase，ATPLuciferin oxyluciferinhudtotidt Fn匚CiFpQF聶tiom 年曲nelightas a peak in

26、the pyrogramnucleotide sequence c C a m cc右1 A 唏 Q Tnucleotide addedSulfuYlasecAPS 屮 PPi ATPluciferin oHyluctferinrvATP Liqht光信号由CCD摄像机检测并由软件pyrogram反应为峰。每个光信号的峰高与反应 中掺入的核苷酸数目成正比。第四步一ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生 反应体系。d NTPdN D P + dN M P * phosphateATP 棟IW。 a0P + AMP + pLosphal第五步一然后加入下一种dNTP。

27、在以上步骤循环进行中，互补DNA链合成，序列从pyrogram的信号峰中决定。cc丁CTG品人Uicilerase證 uHurylanATP T利用 PSQ96 系统进行测序分析可期望得到 20-30 个碱基的读序长度，但是和任何测序 技术一样，最大读序长度取决于模板的二级结构、碱基组成、PCR产物质量和其他参数。最佳化的 PyrosequencingPyrosequencing 反应利用的是酶级连系统，简单且强有力，给出阳性或阴性结果，每种成 份和参数已最佳化，以得到高度一致的结果，精确度为99%。* 底物浓度已最佳化*选择了 Apyrase的特异浓度，保证了所有的dNTP被降解，包括ATP

28、和dATPS* dNTP降解速率慢于掺入速率，有利于dNTP充分掺入* ATP合成速率快于ATP水解速率，使的ATP浓度和光产生正比于掺入的dNTP 数目* 仔细控制的试剂，保证了足够的活性和质量待测序模扳制备通过 PCR 技术将待测序列扩增，其中引物之一在合成时用生物素标记。加入STREPTAVIDIN包被的磁珠于扩增的DNA中，DNA分子通过引物的生物素和STREPTAVIDIN包被的磁珠形成复合体。DNA变性后，带生物素标记引物的单链在磁场中得到纯化，然后就可用于与测序引物退火，以便进行测序反应。PSQ 96 系统系统工作流程1, 基因组 DNA 提取2, 设计和合成 PCR 引物，其中

29、之一标记生物素; PCR 反应3, DNA双链的分离，含生物素的单链DNA与测序引物的退火4, 对含生物素的单链DNA的测序/基于测序的SNP分析及等位基因频率确定PSQ96 系统包含了进行上述工作(3-4)的仪器及配件、软件、试剂，系统的设计满足高通 量、快速、精确和经济的要求。Pyrosequencing技术的突出优势在于Pooling，适用于大规模的等位基因频率分析，但需 要特殊的仪器,硬件成本高；17、等位基因特异性扩增技术(allele-specific PCR或 amplification , ASPCR或 ASA)ASPCR是一项在PCR基础上发展起来的新方法，通过PCR和凝胶电

30、泳即可检测出DNA 中各种点突变。ASPCR的基本构思是设计2个ASO引物，使之与另一引物构成PCR反应体系。这2 个引物与探针的ASO不同，等位基因特异性碱基不是位于ASO中间，而是置于引物的3 端。这种设计是基于耐热Taq DNA聚合酶缺乏3-5外切校正活性的特点。引物3端的 特异碱基分别互补于野生型和突变型等位基因的相对碱基，若此碱基对形成错配，链延伸反 应就会因3 ,5-磷酸二酯键形成障碍而受阻，故此法又称扩增受阻突变体系(amplification refractory mutation system , ARMS)。其扩增结果为：“野生”模板阻碍，“突变”引物放大； 或“突变”模板

31、阻碍,“野生”引物放大。ASPCR点突变的检出率依赖于反应条件的优化和防止引物与靶DNA错配时可能发生 的错配延伸，这可通过调整实验条件如：引物、靶 DNA、 Taq 酶的浓度和反应温度等来提 高特异性，在反应体系中加入甲酰胺亦可减少非特异性扩增。还可通过人为地使引物3末 端的第二个碱基发生错配来阻止错误延伸。近来又有报道：在ARMS的反应体系中，引物上标记2个不同荧光素，通过对产物荧 光分析即可了解到模板中是否存在点突变，此法称为双荧光扩增受阻突变系统( double fluorescent-amplification refractory mutation system, dF ARMS)

32、18、荧光原位杂交技术(北京金菩嘉)荧光原位杂交技术是一门新兴的分子细胞遗传学技术，其原理是采用荧光标记的DNA探针， 利用探针与被检测样本中DNA碱基对的互补性，在探针与样本的DNA杂交后，通过荧光 显微镜检测荧光信号而得出结果，从而检测细胞、组织样本中的染色体或基因异常。它将荧光信号的高灵敏度、安全性，荧光信号的直观性和原位杂交的高准确性结合起来，通 过荧光标记的DNA探针与待测样本的DNA进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进 行辨别和计数，从而对染色体或基因异常的细胞、组织样本进行检测和诊断，为各种基因相 关疾病的分型、预前和预后提供准确的依据。FISH 具有良好的稳定性和可重复性。

33、目前免疫组织化学法正广泛应用于肿瘤等多个领域的 临床诊断。免疫组化的检测对象是疾病相关的蛋白。由于蛋白的表达和本身的构象受各种因 素的影响很大(例如酸、碱和变性剂)，检测条件的稳定性对检测结果至关重要。此外，免 疫组化检测结果的判断依赖于检测者对显色结果的主观判断，对于一些弱阳性的结果，不同 的检测者容易产生分歧。上述的因素都可能影响医生对病情的最终诊断。荧光原位杂交技术 检测的对象是细胞中的DNA，致密的双螺旋结构使DNA可以历经千百万年而依然保持良 好，其结构稳定，不易被环境条件影响，为荧光原位杂交技术的稳定提供了良好的基础。此 外，荧光原位杂交结果的判定借助于对荧光的颜色判断和信号计数，客观地量化了检测地结 果。如果借助于相应的FISH操作系统（例如Abbott-Vysis公司的Hybrit杂交仪和VP2000 样本预处理系统）和染色体成像系统（例如AI公司的CytoVision）就能实现整个FISH操作 的自动化，最大限度的降低操作者和检测者的主观因素，确保结果的准确性。