体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则

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1、附件10：体外诊断试剂分析性能评估指导原则参考值（参考区间）（征求意见稿）一、概述参考值（参考区间）是体外诊断试剂的重要指标之一，也是临床使用中判断被检测样本 是否正常的重要依据。参考值（参考区间）评估资料是评价拟上市产品有效性的重要依据， 也是产品注册所需的重要申报资料之一。本指南基于国家食品药品监督管理局体外诊断试剂注册管理办法（试行）（以下简称 办法）的有关要求，参考CLSI有关标准，对参考值（参考区间）的有关定义、实验所 需材料、实验过程及实验结果处理进行了原则性要求，包括建立参考区间的方法学和程序。 其目的是为生产企业对定量检测和确定健康相关的参考值（参考区间）进行评估及准备参考 值

2、（参考区间）评估资料提供原则性指导，也为注册管理部门审核参考值（参考区间）评估 资料提供技术参考。同时，本指南亦可指导临床实验室进行参考值（参考区间）的确定或转 移。由于体外诊断试剂产品发展速度快、专业跨度大，国家食品药品监督管理局将根据体外 诊断试剂发展的需要，适时对本指南进行修订。二、定义1. 参考个体：根据设计标准筛选出进行实验的个体（确定一个人的健康状况通常是非常重要的）。2. 参考人群：由参考个体组成的群体。（参考人群的数量通常是未知的，因此它是一个假定的实体。参考人群也可以由一个人组成，例如为自身或其他人做参考。主题特异性参考 个体在本指导文件中不包含在内。）3. 参考样品组：选出

3、适当数量的个体以代表参考人群。4. 参考值：经过对一定数量参考个体的测量和观查，所获得的检测结果。（对参考个体的实验结果，参考值源于参考样品组）5. 参考值分布：一组参考值的分布。6. 参考样本组的参考值分布：通过测定，并用适当的统计方法进行处理。7. 参考人群的参考值分布：评估参考样本组的参考值分布，并用统计方法进行处理。8. 参考限：源自参考值的分布，用于描述部分参考值的位置（小于或等于、大于或等于、 下限/上限。9. 参考区间：参考值低限和高限之间。如：GLU : 3.66.1 mmol/L。有时只有参考值 高限（X）有意义，其参考区间为：0X）。10. 观测值：病人样本的实验室检验结果

4、，与参考值、参考值分布、参考限、参考区间 作比较。三、参考值（参考区间）评估的基本原则1. 选择参考个体1.1 概要健康是一个缺乏统一定义的概念，因此，确定排除非健康的标准是选择参考个体的第一 步。每一项研究均有不同的健康标准。一个准参考个体的健康状态需经过一系列检查才能确 定，这些检查包括病历检查或现状态生理指标的临床实验检查。用于参考值研究的标准应具 有详细的描述和证明，实验操作者根据此标准来判定参考样品组的健康状态，调查问卷可用 于评价每个参考个体的健康状态。1.2 排除和分组排除标准详细规定了准参考个体的非健康状态，用于排除非健康参考样本。表-1列出了 基本的排除标准，此表并没有囊括所

5、有的排除标准，每个项目应根据实际情况细化排除标准 分组标准详细规定了组别特征。最常用的分组标准是年龄和性别。表-2还列出了其它的分组 标准。各个项目可根据实际情况进行调整。排除和分组的最佳方法是调查问卷的方式。调查 问卷常只需要回答“是”或“否”即可确定，也可与体检同时进行。表-1 排除标准饮酒疾病（最近）献血哺乳期血压（异常）肥胖药物滥用职业处方药口服避孕药自服药怀孕环境因素手术（最近）空腹或不空腹吸烟遗传因素输血（最近）住院（最近或正在）维生素滥用表-2 分组标准年龄采样时的体位血型种族生理变异性别食物月经周期种族背景孕期运动采样时间禁食与非禁食吸烟地理位置1.3 选择参考个体：健康参考值

6、的参考个体不要求是健康年青人，他们应与疾病人群相似。许多情况下，年 龄相关的参考区间更适用于临床诊断。但有些情况下，与年龄相关的实验室指标改变可能不 代表健康状况的变化，如老年人的总胆固醇或生长激素水平改变。除非特别需要（婴儿、老 年人），参考个体通常不应是临床病人。1.4 抽样调查问卷：为了保护参考个体的权益，应确保问卷信息和检测结果的保密性。调查问卷的内容详见图-1。所有信息将严格保密，仅用于患者疾病诊断。项目ID#样本ID#姓名：电话：地址：年龄：性别：民族：身高：体重：职业：医师姓名：您认为自己健康吗？是否您进行规律性的锻炼吗？如果是，练习时间（小时/星期）：练习强度：（轻）1 2 3

7、 4 5 6 7 8 9 10 （重）最近曾经生病？是否如果是，生病时间：疾病名称：您正在服药吗？是否如果是，服用哪些药品：您是否咼血压？是否您是否服用维他命营养品？是否如果是，服用哪些营养品：您在工作是否接触危险化学品？是否如果是，接触哪些化学品：您是否吸烟？是否如果是，香烟种类：您是否有特殊饮食习惯？如果是，请描述：吸烟频度：是否您是否饮酒？是否如果是，酒品种类:饮酒频度：您是否正在接受医生治疗？是否如果是，原因：您近期是否曾经住院治疗？是否如果是，原因：地点:您是否有家族遗传病？是否如果是，遗传病描述您近期是否服用阿司匹林或其他止痛药？是否如果是，原因：时间您近期是否服用抗酸药或其他胃病

8、药？是否如果是，原因：时间:您近期是否服用减肥药？是否女性调查者：是否月经？是否如果是，上次月经期的时间如果否，是否接受荷尔蒙调节治疗？是否是否在哺乳期？疋否是否怀孕期？是否2. 分析前和分析中需考虑的因素2.1 项目准备：对所有的分析前条件，包括项目准备、样品收集和处理、分析方法、仪器，应进行严格限定，限定条件应可同时应用于参考个体和患者人群。一般情况下，分析前应考虑两个因素，即生物学因素和方法学因素。生物学因素包括代谢和血液动力学，方法学因素包括样品收集和处置等。见表-3和表-4表-3 关键因素总结生物学因素方法学因素可变性和标准化来源代谢样本收集特殊因素（采样时的体位等）血液动力学样本转

9、移多重因素（见表-2）酶感应样本处置细胞破裂表-4 需考虑的预分析因素项目准备样本收集样本处置前期食物采样时环境条件运输禁食与非禁食时间血液凝结停止用药体位血清或血浆的分离摄取药物样本种类贮存按照生物节奏取样采样部位分析准备物质活性部位准备采样前休息的时间血流量紧张度设备/技术2.2 样本的种类、收集、处置和贮存 实验室应有样品收集、处置和贮存的标准操作手册。选择适宜的采血管，采血管不能引 入外源性干扰。确定样本是否可在厌氧条件下贮存。不应使用溶血、脂血、黄疸的血清或血 浆样本。2.2.1 血样 如果选择的样本为血样，应确定需要的是动脉血、静脉血还是毛细血管血。样本需要抗 凝时，应选择抗凝剂，

10、应明确样本的采集方法。2.2.2 其它体液样本 其它的体液样本包括尿液、脑脊液、胸膜积液、腹腔积液、心包积液、关节内滑液、羊 水和唾液等。应注意体液收集的时间段。2.2.3 温度 应明确样本收集和贮存的温度。通常情况下，样本在采集后，应尽快进行处置和检测， 尽量减少放置时间。2.3 分析方法特征 实验室应对所用检测方法进行细致的描述和规定，应建立不精密度、不准确性、最小检 测限、线性、回收率、干扰特征的评价准则。四、参考值（参考区间）评估的方法和结果报告1. 新的分析物质或分析方法1.1 方法描述 此方法适用于新分析物、新分析方法及以前的分析物参考值的建立。健康人群某分析物 质参考值的产生和参

11、考区间的估计，应根据一个详细限定条件的方法进行，这些条件限定包括以下几点。（1）根据医学科技文献，建立适宜的生物变异和分析干扰的项目列表。（2）建立选择、排除及分组标准，设计适宜的调查问卷，以揭示潜在参考个体的标准（3）参加参考区间实验的参考个体应签署书面同意协议，并完成调查问卷。（4）按照问卷结果及其它适宜的健康分析结果，对潜在的参考个体进行分类。（5）根据排除标准或体检结果，从参考样品组排除不符合要求的参考个体。（6）根据所需要的参考限，决定适宜的参考个体的数目。（7）用被分析物检测的常规方法，对被选择的参考个体进行采样。（8）按照常规方法对样本进行收集和处理。（9）按照被评价方法分析样品

12、，收集数据。整个过程与常规的操作保持一致。（10）检测数据，设计图表，以评价数据分布。（11）识别可能的数据错误。（12）选择估计方法、估计参考限和参考区间，对参考区间进行分析。（13）对以上的步骤进行证明。1.2 结果分析参考区间包括两个值，即参考上限和参考下限。对于大多数分析物，以2.5%为低限， 以97.5%为高限，通常确定范围在2.5% 97.5%的测定值为参考值。有时，只有参考上限具 临床意义。对于单侧指标，可以确定第5百分位数或第95百分位数为参考值。1.2.1 所需最少的参考个体数：120个观测值可以满足90%的置信限，153个观测值可以满足95%的置信限，198个观测 值可以满

13、足99%的置信限。作为通行标准，推荐一个分析项目至少需要120个参考个体数。 如果实验分组，每一组至少需要120个参考个体数。如果这120个参考值中，有不符合健康 条件的值，将其排除后，应补测符合标准的值，最终总体参考值不少于120个。1.2.2 离群值的处理：设定比值D/R，其中。=最大值-次大值，或D=最小值-次小值，R为所有观测值的极差。 如果D1/3R，则极值应被删除。当两三个离群值处在数据分布的一侧时,D1/3R规律常常 不能识别出极值是否是具有显著水平的异常值。这种情况下， 1/3规律应将最小的极值认定 为离群值。1.2.3 参考值分组： 对不同性别、不同年龄之间参考区间的差异应进

14、行验证，每一组至少应选择120个参考 个体。一般情况下，如果两组数据具有显著性差异，则参考区间应分别报告。两组之间平均 值差异应用z检验进行验证。第一步，每组先检测60个个体。每一组平均值的显著性差别应 用标准正态检验。其中：、:二和、分别是两组实验的平均值；二和二分别是两组实验的方差；二二和二二分别是两组实验的参考值的数量；Z检验是非参数检验，无论原始数据是否高斯分布，均可应用Z检验。但如果原始数据分布的偏倚十分明显，则应进行log转换，转换后的数据分布尽可能接近高斯分布，然后再 应用z检验，对转换后的数据进行检验。z的临界值丁按照下式进行计算：=3（口 平均/120）=3 （Hi + 心）

15、/240宀另外，应检查标准偏差较大者，如二，是否大于1.5二。或者二八二-二|是否小于3。例 如 ， 如 果 在 取 样 的 第 一 阶 段 ， 参 考 值 的 平 均 数 量 为 60 ， 则=3（60/120）2 = 2.12如果参考值的平均数量达到了 120，则=3- l-O/l-Oj1 : = 3如果参考值的平均数量达到了500 ,则丁八 500/120 j- : = :： 12在各情况下，如果z值超过了对应的丁值，两组之间即存在显著性差别，应分别报告参考区 间。2.已有的分析物质或分析方法2.1 方法描述 此方法适用于将已知的有效参考值（参考区间）从供给实验室转移到接收实验室。在适宜

16、的情况下，如果检测主体、方法学、取样方法均具有兼容性，参考值（参考区间）的转移 是可行的。测量系统之间的可比性可以通过相应的方法进行验证。2.2 参考值（参考区间）的转移参考值（参考区间）的转移是一个复杂的过程，为了使参考值具有可接收性，需要满足 一定的条件。可接收的转移条件应视具体情况而定：2.2.1 使用相同的分析系统（方法和仪器）：（1）在相同的实验室里；（2）从一个实验室到另一个实验室；检测主体来自相同的地区或相同的人口统计学总体；检测主体来自不同的地区或不同的人口统计学总体；2.2.2 使用不同的分析系统（不同的方法和不同的仪器）：（1）在相同的实验室里；（2）从一个实验室到另一个实

17、验室；检测主体来自相同的地区或相同的人口统计学总体；检测主体来自不同的地区或不同的人口统计学总体；如果首次参考值（参考区间）的测定已经完成，则不同参考值（参考区间）的转移应着 重注意两个事项：即分析系统的结果可比性和样本总体的可比性。整个的分析前过程及分析 过程，均应与首次参考值（参考区间）确立过程保持一致。2.3 参考值（参考区间）确认：有三种方法可用于参考值（参考区间）转移可接收性的评价。2.3.1 参考值（参考区间）转移可接收性可以通过对首次适宜参考值研究的相关要素的 检查来进行评估，包括参考总体的地区和人口统计学同质性，分析前和分析程序，分析操作， 参考值（参考区间）的描述和调整，估计

18、参考值（参考区间）的方法等。如果初始参考值（参 考区间）的研究资料详细，接收实验室的上述条件均与初始参考值（参考区间）研究相同， 参考值（参考区间）可以直接进行转移，不需要进行确认实验。2.3.2 如果用户或接收实验室希望对厂家或其它实验室所报告的参考值（参考区间）进行确认实验，应对较少数量的参考个体（n=20 ）进行参考值（参考区间）实验，并将结果 与首次研究结果进行比较。在此研究中，整个过程应与首次研究保持一致。这20个参考个 体应具有接收实验室健康人群的代表性，并满足排除和分组标准。如果接收实验室检验主体 的人口统计学与首次研究的检验主体不具有同质性，即存在明显差别时，参考值（参考区间）

19、 不可进行转移。如果20个检验主体中有2个以下的值落在首次研究的95%参考限之外，则首 次参考值（参考区间）可被转移。如果3个以上检验主体的值落在95%参考限之外，则用户 应重新检查分析程序，检查两个参考总体人群是否具有同质性，是否需要按照规模性实验指 南建立适合自己实验室的参考值（参考区间）。此方法介绍接收实验室按照厂家或权威实验 室提供的方法，检测20个参考个体，如果只有两个以下参考个体的值落在首次参考限以外， 则应接收厂家或权威实验室提供的参考值（参考区间）。2.3.3 用户或接收实验室希望对厂家或其它实验室所报告的参考值（参考区间）的转移进行确认实验，也可以对60个参考个体进行参考值（

20、参考区间）实验，将测定结果与所提 供的首次参考值（参考区间）进行比较。在此研究中，整个过程应与首次研究保持一致。如 果接收实验室检验主体的人口统计学与首次研究的检验主体不具有同质性，即存在明显差别 时，参考值（参考区间）不可进行转移。参考个体的选择，参考值（参考区间）的获得应与 首次参考值（参考区间）研究相一致，数据经检查和离群值的排除之后，将小样本的参考值 （参考区间）数据与首次大样本的参考值（参考区间）数据进行显著性检验，如果检验结果 不存在显著性差异，则接收所提供的首次参考值（参考区间）。如果存在显著性差异，应进 一步取样，进一步比较，或者进行全规模的参考值（参考区间）研究。2.4 参考

21、值（参考区间）的报告：试剂生产企业如果提供参考值（参考区间）研究，则应提供实验室设备、数据处理系统、 参考值（参考区间）覆盖范围，参考人群的选择等具体的参考值（参考区间）来源的条件。 体外诊断试剂生产企业在产品标识上应提供参考值（参考区间），并说明参考值（参考区间）所引用的文献。在此文件中，应详细列出参考样本的数量，选择标准，分析前和分析变量控 制，统计学处理方法等。生产企业应识别分组因素，为每一个具有显著性差别的组别提供参 考值（参考区间），并且说明是否对组之间的差别进行了检验，如性别、年龄、饥饿/非饥 饿、一天中的取样时间、妊娠、体位等。生产企业使用的参考人群应具有与其市场类似的分 布。为了易于参考值的转移，生产企业应提供详细的研究过程及结果。