图位克隆-李金伟.ppt

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1、图位克隆技术原理 李金伟 2012215423 无论头上是怎样的天空，我准备承受任何风暴 。 内容简要 图位克隆技术的基本原理 1 图位克隆的一般步骤（ 考研 ） 2 图位克隆在植物基因分离中的应用 3 图位克隆的现状和前景 4 图位克隆技术的基本原理 图位克隆 (Map - based cloning) 又称定位克隆 (positional cloning) , 1986 年 首先由剑桥大学的 Alancoulson 提出，是近几年 来随着各种植物的分子标记图谱相继建立而发展 起来的一种行的基因克隆的一种方法 图位克隆技术的基本原理 基本原理： 功能基 因在基因组中都有相对较稳定的基因座，

2、再 利用分子标记技术对目的基因精细定位 的基础上， 用与 目的基因紧密连锁的分子标记筛选 DNA文库 （包括 YAC,BAC,TAC或 Cosmid等），从而 构建基 因区域的物理图 谱 ，再利用此 物理图谱通过染色体 步（ chromosome walking） 逼近目的基因或通过染 色体登陆（ chromosome landing）方法最后找到包 含有该 目的基因的克隆 ，最后经过 遗传转化试验证 实目的基因功能。 图位克隆的一般步骤 图位克隆的主要步骤 （复旦大学 2003细胞生物学考研试题） 图位克隆的一般步骤 2.1 2.2 2.4 筛选与目的基因 紧密 连锁的分子标记 目的基因的定

3、位 目的基因的筛选和鉴定 2.3 构建高质量、容易操作的大片段基因组文库 图位克隆的一般步骤 2.1筛选与目的基因连锁的分子标记 筛选与目标基因连锁的 分子标记 （ molecular markers） 是实现基因图位克隆的关键。实质上，分子标记是一个特异 的 DNA片段或能够检出的等位基因，精确的分子标记能够极 大地提高图位克隆的效率。 迄今为止，已有几十种技术可用于分子标记的筛选，包括 有： RFLP标记、 RAPD标记、 AFLP标记、 SSLP标记、 SSR标记 、 SNP标记等。其中最为常用的是 简单序列长度多态性（ SSLPs） 和 单核苷酸多态性（ SNPs） 图位克隆的一般步骤

4、 SSLPs SSLP是基于 PCR的分 子标记，检测比较直接 ，只需要通过设计引物 便可检测鉴定的 SSLP标 记 最为常用的 分子 标记 SNPs SNPs标记的检测也比 较直接，它是不同生态 型之间基因组中的单个 核苷酸的差别，这些差 别的核苷酸通常位于不 编码区域，常见的检测 SNPs标记的方法主要是 剪切扩增多态性序列（ CAPS），它是基于 PCR的 图位克隆的一般步骤 图位克隆的分子标记示意图 图位克隆的一般步骤 2.2目的基因的定位 目的基因的定位分为 初定位 和 精细定位 图位克隆的一般步骤 2.2.1初定位 目的基因初定位是利用分子标记在一个目标性状的分离 群体中把目的基因

5、定位于染色体的一定区域内。 初定位通常使用 近等基因系法 或 群组分离分析法 。近等 基因系是指只有目标性状基因有差异其他性状基因相同的 2 个群体，可以通过连续回交的途径获得。群组分离分析法， 将分离群体中的研究的目标性状根据其类型分成 2组，将每 组内一定数量的植株 DNA等量混合，形成 2个池，这 2个池仅 在目标性状上有差异。利用分子标记技术寻找 2个池的扩增 谱带的差异，这种多态性极可能与目标基因连锁。用所有的 分离后代单株，验证该多态性是否真正与目标基因连锁及连 锁距离的确定。如果分离群体不易获得，可采取混合样品法 图位克隆的一般步骤 2.2.2精细定位（最艰难、最耗时的限速步骤）

6、 在初步定位的基础上，接下来就要利用高密度的分子标记 连锁图对目的基因区域进行区域高密度分子标记连锁分析以 便精细定位目的基因。 精细定位通常采用的方法是 侧翼分子标记 或者 混合样品作 图 。 图位克隆的一般步骤 侧翼分子 标记 指利用初步定位的目的基因两侧的分子标记，鉴定更 大群体的单株来确定与目的基因紧密连锁的分子标记 ， Dixon等（ 1995）利用该方法已成功的将番茄的叶 霉病基因 Cf2精细定位到 40kb的区间。侧翼分子标记 需要对单个植株进行分析，工作效率低 混合样 品作图 指在准确鉴定目的基因表型（单基因控制的隐性突变 ）的基础上，把大群体中单株突变体分成若干组，以 组为单

7、位提取 DNA，形成一个混合的 DNA池进行分析， 根据所有池中分子标记与目的基因发生的重组数来确 定与目的基因连锁最紧密的分子标记及目的基因附近 所有分子标记的顺序 图位克隆的一般步骤 一旦把目的基因定位在某染色体的特定区域后，接下来就 要对其进行精细的作图。目前，作图的类型可分为 2类，分 别是遗传图谱和物理图谱。 遗传图谱 对图位克隆非常重要， 尤其是精细的遗传图谱。 增加遗传图谱上的分子标记数目 是 精细作图的基础，可以通过整合已有的遗传图谱，或者是寻 找新的分子标记来实现。 图位克隆的一般步骤 2.3构建高质量、容易操作的大片段基因组文库 在基因的图位克隆技术中， 高质量的基因组文库

8、的构建 也是克隆成功的关键。图位克隆的基因组文库主要有 Cos质 粒文库和人工染色体文库。 Cos质粒是一种含有 噬菌体的 Cos位点的质粒载体，大小在 5 7kb左右，可高效的地克隆 25 35kb的 DNA片段。人工染色体的插入片段最长可达 2Mb左 右，能够覆盖完整的真核基因，最早发展的人工染色体是 YAC。所以当要克隆大片段 DNA时，需要 YAC作载体。以 YAC为 载体，可将 300 1000kb的 DNA片段克隆。因此以 YAC为载体 可以构建高等植物的完整基因组文库。 图位克隆的一般步骤 2.4目的基因的筛选和鉴定 2.4.1目的基因的筛选 筛选 和 鉴定目的基因 是图位克隆技

9、术的最后一个关键环 节。当一旦找到与目的基因紧密连锁的分子标记并鉴定出分 子标记所在的大片段克隆后，就可以利用该克隆为探针进行 染色体步移 ，逐渐靠近目的基因。 图位克隆的一般步骤 染色体步移是 指利用已知的基因或分子标记来筛选大片 段的 DNA文库获得阳性克隆，如此得到的阳性克隆是“一步 克隆”，再利用新获得的探针对文库进行第二次杂交，得到 与探针具有重复序列的阳性克隆称为“二次克隆”，如此反 复即可取到所需的克隆，获得目的基因 。染色体步移的主要 局限在于当必须经过一个无法克隆的片段时，步移的过程会 被打断 ;当克隆的一端是重复序列时，步移的方向会发生偏 差。 为克服这些弊端， Tanks

10、ley等（ 1995）又发展了 染色体 登陆 的方法。 图位克隆的一般步骤 染色体登陆 是找出与目的基因的物理距离小于基因组文 库插入片段的平均距离还小的分子标记，通过筛选文库直接 获得含有目的基因的克隆 ，他们利用此方法可很快将土豆的 pto基因分离出来。 在与目的基因紧密连锁的分子标记及大片段插入基因组文 库都具备的情况下，就可以以该分子为探针通过菌落杂交， 蓝、白斑挑选的方式筛选基因组文库而获得可能含有目的基 因的阳性克隆。在用覆盖目的基因区域的大片段基因组 DNA 克隆筛选区域特异的 cDNA后，仍需对目的基因编码的 cDNA作 进一步证实。 图位克隆的一般步骤 2.4.2目的基因的鉴

11、定 我们得到的目的基因所在的小片段克隆有可能含有多个 ORF（ open reading frame），从这些 ORF中 鉴定目的基因 是 图位克隆技术的最后一个关键环节，常用的方法是用 含有目 标基因的大片段克隆 如 BAC克隆或 YAC克隆去筛选 cDNA文库 ， 并查询生物数据信息库，待找出侯选基因。 图位克隆的一般步骤 把这些侯选基因进行下列分析以确定目标基因： （ 1）精细定位法检查 cDNA是否与目标基因共分离； （ 2）检查 cDNA时空表达特点是否与表型一致； （ 3）测定 cDNA序列，查询数据库，以了解该基因的功能； （ 4）筛选突变体文库，找出 DNA序列上的变化及与功能

12、的关 系； （ 5）进行功能互补实验，通过转化突变体观察突变体表型 是否恢复正常或发生预期的表型变化。功能互补实验是最直 接、最终鉴定基因的方法。利用新兴的 RNA干扰（ RNAi）也 可有效地确定目的基因 . 图位克隆在植物基因分离中的应用 这些年来，图位克隆技术在模式植物玉米等一些重 要农作物水稻中得到了广泛的应用，分离出了一大批在 农艺生产上有重要应用价值的基因。 图位克隆在植物基因分离中的应用 3.1图位克隆在技术在玉米基因分离中应用 3.1.1一般步骤 作图群体的构建 多态性遗传标记的筛选 、 开发与利用 目的基因的初定位 目的基因的精细定位 候选基因的获得 图位克隆在植物基因分离中

13、的应用 一般步骤 1.图位克隆的遗传 定位原理示意图 2.基于 SNP 位点的 CAPS 和 dCAPS 标 记开发原理 (Lukowitz et al., 2000) 3.SNAP 标记开发原理 (Drenkard et al., 2000) 4.通过测序峰图判定基因型示意图 图位克隆在植物基因分离中的应用 图位克隆过程示意图 注 : A: 玉米 10 条染色体大小 示意图 ; B: 初定位将目的基因 定位在某条染色体短臂上 ; C: 在初定位区间内增加多态性标 记 ,进一步将目的基因缩小在 M14 和 M15 两个 SSR 标记内 ; D:扩大群体并同时增加标记 , 完成目的基因的精细定位

14、 ; E: 以 B73 基因组序列为参考预测 定位区间内可能存在的候选基 因 ; F: 对突变体和突变背景的候选 基因序列进行比较 , 找到突变 基因 图位克隆在植物基因分离中的应用 3.1.2展望 玉米不同自交系基因组的重测序、转录组的大量测序、不 同自交系间 SNP位点的公布以及对基因组结构特点认识的逐 渐深入，将会解决目前图位克隆中遇到的技术问题，进一步 提高玉米图位克隆的成功率。 玉米是重要的粮食作物，也是分子生物学研究的模式植物 ，且属于异花授粉植物，群体构建较易进行，表型观测显而 易见。因此在不久的将来，图位克隆技术必将在玉米中得到 更加广泛的应用。 图位克隆的现状和前景 2.4.

15、3图位克隆的局限性 利用图位克隆法克隆基因不仅需要 构建完整的基因组文 库，建立饱和的分子标记连锁图和完善的遗传转化体系，而 且还要进行大量的测序工作， 所以 对基因组大、标记数目不 多、重复序列较多的生物采用此法不仅投资大，而且效率低 。因而图位克隆法仅局限应用在人类、拟南芥、水稻、番茄 等图谱饱和生物上。 图位克隆的现状和前景 此外，在分析发生的变异的时候，我们最有可能遇到的 复杂情况是一个给定的性状由不止一个的基因位点控制的。 例如，在拟南芥 Kashmir-1（有抗性的）和 Columbia（敏感 的）株系之间的杂交实验中，我们发现粉状霉菌抗性基因至 少涉及三个遗传位点，它们是以附加的

16、方式起作用的。对这 些抗性基因中的任何一个作精细定位都要求降低作图群体的 遗传复杂性，例如通过创造只有一个位点保持多态性的重组 近交系。因此，当影响这些性状的自然或者诱导的突变被定 位的时候，如第二位点修饰成分干扰这些分析而使图位克隆 此类基因变的非常困难； 图位克隆的现状和前景 关于染色体上位点的物理和遗传距离的比值是变化的。 通常这种变化是比较小的，对作图的分辨率也只有较小的影 响（ Copenhaver等， 1998），但如果要定位的基因位于重组 被严格限制的着丝粒附近，精细定位的努力就有可能无效， 且对常染色体序列 1%重组的遗传距离相当于 100400 Kb的物 理距离，然而着丝粒区

17、域 1%重组的遗传距离相当于 1 0002 500Kb，在现存的物理图谱中很少有着丝粒区域被覆盖等这 一切都使图位克隆的染色体步移变的不可能 (Georg Jander et al,2002)。 图位克隆的现状和前景 生命科学研究已进入基因组时代。 图位克隆是最为通用的基因识别途径 ,至少在理论上适用 于一切基因。基因组研究提供的 高精度遗传图谱 、 大尺度物 理图谱 、 大片段基因组文库 和 基因组全序列 ,为图位克隆的广 泛应用铺平了道路。现在 ,图位克隆已经成为分离基因的常规 方法尤其令人鼓舞的是 ,DNA芯片和微列阵的发明为图位克隆 的应用展示了巨大的潜力和光明的前景。 DNA芯片或微

18、列阵 与 SNP和 cDNA相结合在基因的定位、筛选和鉴定方面具有 无比的优越性 ,相信能大大提高图位克隆的效率。 图位克隆发展的最新动向 90年代以来 ,我国先后组织实施了水稻基因组计划和人类 基因组计划。我国科学家紧跟世界新技术的发展 ,积极开展图 位克隆研究 ,在分离、利用水稻和人类的重要基因方面取得了 突破性进展。 1995年 ,中国科学院遗传研究所的宋文源等与美国加州 大学戴维斯分校的科学家合作 ,成功地采用图位克隆方法获得 了水稻的白叶枯病抗性基因 Xa21。 目前我国从队伍建设到基因技术 (包括基因克隆 )的引进 和发展等方面都有相当的基础。考虑到起步较晚和作图、测 序的巨大费用

19、 ,我国的各种动植物基因组研究也只能采取在八 五期间就确定先拿基因的策略。至于拿到基因后的不同植物 有效转化系统的建立则另当别论了。鉴于各种植物的抗病虫 图位克隆发展的最新动向 基因和与品质改良有关的基因对于我国的高技术产业、卫生 保健、农业生产和权益保护等具有特别重要的意义 ,毫无疑问 ,图位克隆对于分离这些基因必将发挥重要的作用 . 图位克隆技术原理 参考文献： 1.宋成标 .图位克隆基因原理与方法 .海南生物技术研发与发展研讨会论 文集 .2006.5 2.吕洪坤 .图位克隆技术在玉米基因分离中的应用 .分子植物育种 .2013. 3.闫其涛 .植物基因分离的图位克隆技术 .分子植物育种 .2005. 4.童继平 .水稻功能基因图位克隆研究进展 .中国生物工程杂志 .2012 5.景润春 .图位克隆技术在分离植物基因的应用 .武汉大学发育生物学研 究中心武汉大学遗传研究所 .2000 6.赵佳 .拟南芥中 ABA与 WUS的关系分析及三个圆叶突变体的图位克隆 .细 胞生物学 .2014 7. 王泽立 .植物基因的图位克隆 .生物技术通报 .2000 图位克隆在植物基因分离中的应用 图位克隆在植物基因分离中的应用 图位克隆在植物基因分离中的应用 图位克隆在植物基因分离中的应用