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1、1 ING4真核表达载体的构建及对胶质瘤 细胞 U87MG增殖的影响 作者姓名（排序）： 李晓梅 作者单位： 哈尔滨医科大学附属肿瘤医院 第一作者姓名及身份证号码：李晓梅 230204197304071424 通讯作者姓名： 耿敬姝 研究背景 INGs（ INhibitor of Growth肿瘤生长抑制因子） 是近些年发现一个肿瘤抑制基因家族，包括 ING1、 ING2/ING12L、 ING3、 ING4 、 ING5和三种酿酒酵母 INGs（ Yng1、 Yng2、及 Pho23） , 它们彼此之间保持较 高的同源性。 ING4基因是新近发现的 ING基因家族的 新成员，定位于人 12q
2、13-32，由 8个外显子和 7个内含子 组成，编码 248个氨基酸分子。其功能可能与负性调 节细胞生长和接触抑制及血管生成有关。 国外研究发现，多种肿瘤中可发现存在 ING4基因 的异常或 ING4蛋白表达的降低，如乳腺癌、直肠 癌、宫颈癌、小细胞肺癌、恶性胶质瘤及头颈部 鳞状细胞癌等。 研究证实 ING4 基因编码蛋白的表达水平随着脑 胶质瘤恶性程度的增高而降低。 ING4 基因在正 常脑胶质细胞中比低度恶性脑胶质瘤中的表达水 平高 2 3倍，比高度恶性脑胶质瘤中的表达水平 高 6倍。我们有理由推测 ING4基因的异常及蛋白 表达降低与胶质瘤发生发展有关。 已研究证实，该因子对神经胶质瘤的
3、基因治疗具 有潜在的重要价值。为了进一步研究该因子对胶 质瘤的治疗价值，我们首先构建真核表达载体 pcDNA3.1-ING4,并利用脂质体 Lipofectamine2000 将其转入 U87MG细胞，通过检测 ING4基因的表达 的改变及胶质瘤细胞 U87MG细胞增殖所发生的改 变，推测证实 ING4对 U87MG细胞增殖的影响，并 进一步探讨 ING4抑制肿瘤细胞增殖的机制是否与 p53及 cyclinB1有关。 材料与方法 1. ING4基因的克隆、序列测定和真核表达载体的构建 。 引物设计 扩增目的基因片段 目的基因 ING4克隆及 真核载体 pcDNA3.1-ING4的构建 重组质粒
4、的抽提纯化 、测序和鉴定 。 2. U87MG细胞培养、 ING4基因转染、筛选和表达。 U87MG细胞采用 DMEM10%进口小牛血清培养 用 Lipofectamine2000将 pcDNA3.1-ING4质粒和空载 pcDNA3.1质粒分别转染 U87MG细胞 在 G418压力下筛 选，建立稳定表达 ING4细胞模型 提取转染 ING4克隆 细胞基因及总蛋白，挑选高表达 ING4蛋白的 U87MG细 胞。 3. ING4对 U87MG细胞增殖影响的多方面研究。 细胞计数及生长曲线绘制 细胞集落形成计数 MTT法检测细胞生长情况 观察 ING4对胶质瘤细胞 U87MG放射治疗的是否有增 敏
5、作用 以上实验均以转染空载质粒的细胞作为对照。 实验 给予 6000GY 射线下连续照射。 4. ING4抑制 U87MG细胞增殖的机制的研究。 设计 P53及 cyclinB1 的引物，采用 PCR进行基因扩增；应用 Western-blot方法 提取细胞中的总蛋白，检测分别转染目的基 因 ING4质粒及空载质粒 U87MG细胞中 ING4、 P53及 cyclinB1基因 蛋白表达情况，均以 GAPDH为内参照。 结 果 1.经测序成功扩增出未发生基因突变 的正确的 ING4功能片段，大小为 750bp。 2. ING4在转染目的基因质粒 U87MG细胞中的表达增高 。 3.绘制生长曲线、
6、集落形成试验、 MTT检测显示转染 ING4 的瘤细胞生长受抑。见图 1.2.3 4. ING4增强 U87MG细胞对放射治疗的敏感性 .见图 4 . 0 200 400 600 800 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 pcDNA3.1ING4 pcDNA3.1 0 100 200 300 400 A B A:pcDNA3.1-ING4U87MG B:pcDNA3.1U87MG 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 A B A:pcDNA3.1-ING4U87MG B:pcDNA3.1U87MG 0.32 0.34 0.36 0.38 0.4 0.42 0.44 0.46 A B A
7、:pcDNA3.1-ING4U87MG B:pcDNA3.1U87MG 图 1 图 2 图 3 图 4 5.转染 ING4的 U87MG细胞 P53（图 1）及 cyclinB1（图 2.3） 的表达降低。 图 1 图 2 图 3 讨 论 Gong等在 2004年发现 ING4是一种信号分子，可 以调节细胞的存活、生长。 ING4的表达在人神经 胶质瘤组织中与正常脑组织比较是降低的，其表达 水平由低级别肿瘤到高级别肿瘤是逐渐下调的，提 示 ING4表达下降可能与胶质肿瘤的发生有一定关 系 。 我们构建 ING4真核表达载体，转染低表达 ING4的 U87MG细胞，并通过与转染空载质粒的瘤 细胞
8、进行对照，发现无论是在基因水平还是蛋白 水平转染 ING4质粒的 U87MG细胞能够稳定高表达 ING4蛋白。同时我们进行了几种反映肿瘤细胞生 长增殖速度的实验，实验结果表明转染 ING4的瘤 细胞生长受到了明显的抑制，同时发现转染 ING4 瘤细胞在射线照射下致死率明显高于空载细胞， 说明 ING4能够抑制胶质瘤细胞的生长，可以提高 瘤细胞对射线的敏感性。 ING4是一种核蛋白，其 C端具有核定位信号 与 p53复合定位于细胞核内。 p53是一种多功能 蛋白，它的基本功能是作为转录反式作用因子 调节转录活性。研究表明 ING4功能的发挥是 P53 依赖的，在我们的研究中发现转染 ING4质粒
9、后 瘤细胞中 P53的表达没有增加，是降低的，这说 明 ING4不是 P53的上游基因， ING4表达增强并不 引起 P53水平增高，可能通过调节 P53下游某种 基因的表达来抑制瘤细胞增殖 Shiseki等发现在转染 ING4的 RKO细胞株 48小时后 ING4基因的高表达引起 S期细胞数量减少，以及 G1/S和 G2/M期细胞数量增加，说明抑癌基因 ING4可能引起瘤细胞 G1/S期和 G2/M期发生阻滞 细胞的分裂是由一组称为细胞周期素 cyclin的蛋 白和一组依赖于 cyclin的蛋白激酶 CDK及其抑制物 CDKI所调控的。其中， cyclinB1是细胞周期 G2/M 检测点关键
10、的调控因子。人类多种肿瘤发现有cyclinB1过表达，高表达的 cyclinB1不断促进肿瘤 细胞分裂和增殖，是肿瘤细胞增殖的重要因素。 我们用 RT-PCR及 Western-blot方法分别检 测稳定转染 ING4瘤细胞和转染空载质粒瘤细 胞中 cyclinB1的基因转录及翻译情况，结果显 示稳定转染 ING4的细胞 cyclinB1明显降低，也 就是可能由于瘤细胞高表达的 ING4蛋白抑制 了 cyclinB1基因的转录和翻译，从而提示高表 达 ING4蛋白抑制细胞生长，可能是由于降低 P53下游的 cyclinB1的表达来实现的。 综上所述，我们的研究结果显示，高表 达 ING4蛋白可抑制胶质瘤细胞的生长，它与 P53相互协同并抑制 P53的下游基因 cyclinB1转 录和翻译，使 cyclinB1蛋白表达降低，使胶质 瘤 U87MG细胞发生 G2/M期阻滞，抑制瘤细 胞增殖。同时我们发现 ING4还可以提高胶质 瘤细胞对放射线的敏感性。 ING4对神经胶质瘤的基因治疗具有潜在的重 要价值。
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