《原核表达实验》PPT课件.ppt

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1、实验一： 大肠杆菌表达载体的构 建及融合蛋白诱导表达 生命科学技术学院 2010年 6月 黑曲霉的优化培养 总 DNA或 RNA的抽提 PCR或 RT-PCR扩增 xynB基因 目的基因的 TA克隆 质粒 pMD-xylB EcoRI+XhoI双酶切 凝胶回收试剂盒回收目的片断 xynB 乙醇沉淀回收线性化片断 大肠杆菌表达载体 pET-28(a)+ 酶连 酶连产物转化 E.coli DH5 挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒 (PCR及酶切验证 ) 28S 18S 重组表达质粒转化 E.coli BL21 挑取重组子 , 用菌落 PCR方法验证 IPTG诱导促使目的大量蛋白表达 细胞破碎及蛋白

2、抽提 目标蛋白的纯化 蛋白质浓度测定 -Bradford法 目标蛋白的鉴定 Western biotting 融合蛋白诱导表达流程图 XylB CK 100mM IPTG 1ml LB+Kan 1-I 1+I 2+I 3+I Ck+I 2-I 3-I Ck-I 37 , O/N 37 , 2.7h 37 , 2.7h 37 , O/N 30 , 4 h 28 , 4 h 1ml LB+Kan 3ul 150ul 3ul 3ul 3ul 50ml LB+Kan IPTG 100mM 使用浓度 0.1mM Kan 100mg/ml 使用浓度 50g/ml PBS缓冲液： 137mM NaCl 2.

3、7mM KCl 10mM Na2HPO4 10mM KH2PO4 试剂及缓冲液： 3 SDS缓冲液： 187.5mM Tris-HCl (pH6.8, 25 ) 6% w/v SDS 30% 甘油 0.03% w/v 溴酚蓝 Gel Staining Buffer(每 100ml): 考马斯亮蓝 250 mg 甲醇 45 ml 乙酸 10 ml 水 45 ml Gel Destaining Buffer: 甲醇 100 ml 乙酸 100 ml 加水至 1000 ml SDS-PAGE胶： 30%聚丙烯酰胺 10% SDS 1.5M Tris-HCl pH8.8 0.5M Tris-HCl p

4、H6.8 10% 过硫酸铵（现配） TEMED Tris-甘氨酸电泳缓冲液 25mmol/L Tris 250mmol/L 甘氨酸（电泳级）（ PH8.3） 0.1% SDS 可配成 5 贮存液备用，在 900ml去离子水中溶解 15.1gTris碱和 94g甘氨酸，然后加入 50ml 10%（ w/v） 的电泳级 SDA贮存液，用去离子水补至 1000ml。 操作步骤 1： （小规模诱导 -筛选正确表达克隆子） 1、 从平板上挑取 1个 pET28-xylB/BL21转化子接种于装有 2ml LB/Kan（ Kan浓度 50ug/ml）培养基的 PA瓶中， 37oC， 250rpm， 培养过

5、夜； 2、取过夜培养物按 1%接种量分别转接二个装有 2ml LB/Kan的 PA瓶中， 37 培养约 2小时 40分钟； 3、培养结束后，分别向其中一个瓶加入 IPTG（终浓度 0.1mM） 并标记为“ +I”，另一瓶不加 IPTG标记为“ -I”， 28 培养， 250rpm，约 4小时后收集菌体； 4、从“ +I” 、“ -I”培养瓶中各吸取 1ml菌液于两个标有“ +I” 、 “ -I” 的 1.5ml离心管中 ,离心收集菌体 ,10000 rpm、 RT、 1分钟， 去上清，加入 80ul缓冲液和 40ul 3 SDS上样缓冲液悬浮菌体， -20 保存备用。 5、取前面保存菌体（加入

6、 1 SDS上样缓冲液），置沸水 5分钟（破细胞），然后置室温； 6、在室温以 10000rpm离心 1分钟，取上清 10-20ulSDS- PAGE蛋白电泳检测。 附： SDS-PAGE胶的制备及蛋白质电泳： 12%分离胶配制 (5ml): 水 1.6ml 30%聚丙烯酰胺 2 ml 1.5M Tris-HCl (pH8.8) 1.3ml 10% SDS 0.05ml 10% 过硫酸铵 0.05ml TEMED 0.002 ml 制备 SDS-PAGE胶 分离胶配制时，过硫酸铵和 TEMED先不加，将制胶板跟电泳槽装配好， 制胶板凹面朝向自己方便注胶，然后加入过硫酸铵和 TEMED，将胶液混

7、 合均匀后注入制胶板中，再加入一定量水饱和正丁醇去除气泡。放置 30 分钟，待胶完全凝固，去除正丁醇。然后配制积层胶。 5%积层胶配制 (2ml): 水 1.4ml 30%聚丙烯酰胺 0.33 ml 0.5M Tris-HCl (pH6.8) 0.25ml 10% SDS 0.02ml 10% 过硫酸铵 0.02ml TEMED 0.002 ml 积层胶制作方法跟分离胶制作相似，混合均匀后注入胶板，缓慢的插入 梳子，静置 30分钟，胶凝固后取出胶板，撕掉胶条，拔去梳子，再将胶 板凹面背向自己装好电泳槽。缓慢向内槽倒入 Tris-甘氨酸电泳液，使其 没过凹槽，向外槽倒入与内槽持平的电泳液。 点样

8、：所有的样品和蛋白 Marker点样前都要沸水浴 5分钟使 蛋白质完全变性。一般的点样量为 10-20ul。 点样完毕后即可开始电泳，先以 80伏电压跑 15-20分钟，蛋 白质通过积层胶后，更换到 120伏，待溴酚蓝接近分离胶底 部后停止电泳，取下胶板，小心撬开胶板割取分离胶，放入 染色皿中，加入一定染色液（没过胶面即可）。置于摇床上 染色 30-45分钟。 染色完毕后，回收染色液，加入脱色液，摇床脱色数次，前 面几次可以时间较短，第一次约 10分钟，依次时间稍微延长， 最后一次可以过夜脱色。 蛋白质电泳 1、挑取 1个正确表达目标蛋白的转化子接种于装有 2ml LB/Kan （ Kan浓度

9、 50ug/ml）培养基的 PA瓶中， 37oC培养过夜； 2、按 1%接种量接种于 50ml LB/Kan （ Kan浓度 50ug/ml）中 37 培养约 2小时 40分钟， OD600=0.4-0.6；（ 前两步与 操作步 骤 1相同 ） 3、培养完毕后，向三角瓶中加入 IPTG（ 100mM） 50l，使培 养液中 IPTG终浓度为 0.1mM； 28 诱导培养， 250rpm，约 4 小时后收集菌体； 4、吸菌液 1ml于 1.5ml离心管中，另取 20ml倒入 50ml离心管中 , 离心收集菌体 ,6000 rpm， 4 ,10分钟去除培养基，加入 2ml 1 PBS缓冲液悬浮菌体

10、，然后分装于 2个 1.5ml离心管中， 10000rpm，离心 2分钟，去上清， -20 保存备用。 操作步骤 2： （大规模诱导 -大量表达目标蛋白） 实验二： 大肠杆菌细胞破碎及蛋 白浓度测定 1、取出保存的诱导后的细胞（ 10ml），在冰上缓慢融化后， 加入 1mlPBS缓冲液； 2、置冰上用超声波破碎细胞，将超声波发射探头插入菌液 中，开始超声， 10 sec/次，间歇 15 sec（避免过度产热）， 重复数次（一般 5-6次）直至溶液变清亮；所有过程均需在 冰上进行； 3、在 4 、 13000rpm离心 20分钟，可溶性蛋白存在于上清 液中，不溶性蛋白存在于沉淀中； 4、取上清液

11、于另一干净的 1.5ml离心管中，取 40l上清液测 定总蛋白的浓度。 采用 BSA法测定蛋白浓度（ Bradford, 1972），首先 作好标准曲线，然后将样品测得的 OD在标准曲线上比较后 获得样品蛋白质浓度。 方法： 1、完全溶解 BSA蛋白标准品 (5mg/ml)，用 PBS将标准品稀释 成 100-500 g/ml的溶液 2、分别取 40L的不同浓度的溶液加入到 1mL考马斯亮蓝试 剂中，摇匀，室温反应 3-5 min后，在 595 nm处测定光吸收 值。 3、以光吸收值为横坐标，标准蛋白含量为纵坐标，绘制标 准曲线。 蛋白浓度标准曲线的绘制 蛋白浓度标准曲线 y = 1452x

12、+ 10.777 R 2 = 0.9914 0 100 200 300 400 500 600 0 0.1 0.2 0.3 0.4 吸光度 浓度（ g/ml) 1、取出保存的诱导后的细胞（ 10ml），在冰上缓慢融化后， 加入 1mlPBS缓冲液； 2、置冰上用超声波破碎细胞，将超声波发射探头插入菌液 中，开始超声， 10 sec/次，间歇 15 sec（避免过度产热）， 重复数次（一般 5-6次）直至溶液变清亮；所有过程均需在 冰上进行； 3、在 4 、 13000rpm离心 20分钟，可溶性蛋白存在于上清 液中，不溶性蛋白存在于沉淀中； 实验三： 表达蛋白的纯化 4、细胞破碎上清液中，加入

13、 Ni-NTA树脂柱，在 4 下结合 1h， 每 5分钟摇动一次 ；然后 5000 r/min离心 1 min移除上 清液； 5、加入 10 mmol/L咪唑 (imidazole)， 50 mmol/L pH7.5 磷酸缓冲液 (PBS buffer)，在 4 条件下洗涤 30min，弃上 清；重复洗涤 3次，保留 Ni-NTA柱； 6、加入 250l 100 mmol/L咪唑 (imidazole)、 50 mmol/L pH7.5磷酸缓冲液 (PBS buffer)洗脱液，在 4 条件下洗涤 30min后 5000 r/min离心 1 min，用移液器小心收集上清 （应尽量避免吸到离心管

14、底部的 Ni-NTA柱），置于新的 1.5ml离心管中， -20 贮存备用。 实验四： 表达 蛋白的鉴定 -western杂交 操作步骤 1 蛋白质电泳 取 -20 保存的纯化好的蛋白样品（洗脱收集的上清） 50l，用 PBS十倍稀释；取 50l稀释液，加入 25l 3 SDS上样缓冲液，沸水水浴 5分钟； 领取一管（每块胶） GST蛋白样品作为阴性对照 领取一管（每块胶） xylB蛋白样品作为阳性对照 各样品在室温以 10000rpm离心 1分钟，取上清 10-20ul SDS-PAGE蛋白电泳。 操作步骤 2 蛋白质的半干式电转移 （戴手套操作） 将蛋白胶的积层胶切除 (当胶上的样品较少时

15、，不含目 的蛋白的胶应都切除，使剩下的胶块尽可能小 )，然后 浸入 Towbin buffer中平衡； 预先准备专用的滤片 2张 (或 18张滤纸 )和 1张硝酸纤维 素滤膜，其大小都应与凝胶大小吻合；用铅笔在滤膜 一角做好标记； 将 1张滤片 (或 9张滤纸 )在 Towbin buffer中浸润后放 置在电极上 (如用 9张滤纸则应逐张叠放整齐 ) ，用玻 璃棒挤出所有气泡。（ 具体摆放顺序见下图 ） 于 Towbin buffer中浸润硝酸纤维素滤膜，然后置于滤纸 /片 上，排出气泡； 然后将平衡好的蛋白胶置于硝酸纤维素滤膜上，排出气泡； 再依次将另外 9张滤纸 (1张滤片 )在 Tow

16、bin buffer中浸润后放 置在蛋白胶上。 加上阴极电板， 25V电压转移 40分钟。 转移完成后，取出 NC膜，在 TBS漂洗 5min，置入丽春红染 液中染色，出现蛋白条带后，用自来水漂洗 1min，用铅笔标 记处蛋白质 Marker的位置，然后加入 TBS漂洗至颜色消失； 9层滤纸电转缓冲液 9层滤纸电转缓冲液 阳极 (+) 阴极 (-) Trans-Blot SD with Gel Sandwich 操作步骤 3 膜的封闭 用含有 5脱脂牛奶的 TBS-T封闭 NC膜（含有 0.1%吐温 20的 1倍的 TBS），在室温条件下孵 育 1至 2小时 (推荐在 4 条件下孵育过夜 )；

17、 用 TBS-T漂洗： 15分钟， 1次； 5分钟， 2次。 在室温条件下，将 NC膜转入含有 1脱脂牛奶和合 适稀释度的一抗的 TBS-T溶液中（ 1:1000），孵育 1至 2小时； 用 TBS-T漂洗： 15分钟， 1次； 5分钟， 2次。 操作步骤 4 一抗杂交 操作步骤 5 二抗进行杂交 在室温条件下，将 NC膜转入含有 1脱脂牛奶 和合适稀释度的二抗的 TBS-T溶液中 (1:5000)， 孵育 1小时； 用 TBS-T漂洗： 15分钟， 1次； 5分钟， 3次。 用 TBS漂洗： 5分钟， 3次 操作步骤 6 DAB（ 3, 3二氨基联苯二胺）显色检测 加适量显色液至将膜浸没，观

18、察，出现清晰的条 带（最多 5分钟）即可加入蒸馏水终止反应。 Towbin Buffer： 25mM Tris pH8.3 192mM glycine 20% methanol 10 TBS缓冲溶液（ 1L） Tris-Base 24.2g ， NaCl 80g ， pH7.6 显色液 (10ml)： DAB 6mg 0.01 M Tris-HCl (pH7.6) 9ml 0.3% CoCl2 1ml 30% H2O2 10ul 缓冲液配方： 第一组，第二组，第三组，第四组 配 YPD液体培养基 3L 葡萄糖 20g，酵母提取物 10 g，蛋白胨 20g， pH6.5定容至 1L 分装 20m

19、l/250ml三角瓶， 75瓶 200 ml/500ml三角瓶， 7瓶 第五组，第六组，第七组，第八组 配 BMMY液体培养基 4L 酵母提取物 10 g，蛋白胨 20g，酵母氮碱 3.4g，硫酸铵 10g， 用 pH7.0的 0.1M的磷酸钾缓冲液定容至 1L。 （ pH7.0 0.1mol/L磷酸钾缓冲液： 1mol/L K2HPO4 61.5ml， 1mol/L KH2PO4 38.5ml，定容至 1L，调节 pH，定容至 1L） 分装 50ml/250ml三角瓶， 75瓶 第九组，第十组，第十一组 PA瓶 100个， 50ml离心管 100个，洗好包好，灭菌 250ml三角瓶 200个

20、洗好 500ml三角瓶 50个，试剂瓶 20个洗好 第十二组，第十三组，第十四组 配 LB液体培养基 6L 胰蛋白胨 10g，酵母提取物 5g， NaCl 10g， pH7.0定容至 1L 分装 50ml/250ml三角瓶， 40瓶 200 ml/500ml三角瓶， 20瓶 第十五组 配置 10% SDS（ w/v） 500 ml Tris-甘氨酸电泳缓冲液 : 配成 5 贮存液备用，在 900ml去离子水中溶解 15.1gTris碱和 94g甘氨酸， 然后加入 50ml 10%（ w/v）的电泳级 SDS贮存液， 用去离子水补至 1000ml。 染色液 Gel Staining Buffer

21、 1L 考马斯亮蓝 2.5 g，甲醇 450 ml，乙酸 100 ml，水 450 ml 脱色液 Gel Destaining Buffer 5L 甲醇 100 ml，乙酸 100 ml，加水至 1000 ml 培养基 LB培养基 胰蛋白胨（ TRYPTONE） 10g，酵母浸出物 5g，氯化钠 10g，调 pH至 7.0，用蒸馏水定容至 1L。 YPD培养基 蛋白胨（ Peptone） 20g，酵母浸出物 10g，葡萄糖 20g， 调节 pH至 6.5，用蒸馏水定容至 1L。 BMMY 蛋白胨（ Peptone ） 20g，酵母浸出物 10g，酵母氮碱 3.4g，硫酸铵 10g，用 pH7.0的 0.1mol/L磷酸钾缓冲液定 容至 1L。