蛋白质的分析方法

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1、蛋白质分析方法1、微量凯氏(Kjeldahl)定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化)，氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经 强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品 之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：NH2CH2COOH+3H2SO42CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成，反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入CuS04作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可

2、用硼酸 溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以625即得。评价： 总氮-非蛋白氮=蛋白质氮蛋白质含量 灵敏度低，误差大，耗时长。2、双缩法（Biuret 法）(一) 实验原理双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180C左右加热，放出一个分子氨后得到的 产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个 酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲 反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋

3、白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用 来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺 点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。(二) 试剂与器材1. 试剂：(1) 标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准 蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，

4、再根据其纯度，称量配 制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCI配制，酪蛋白用0. 05N NaOH 配制。(2 )双缩脲试剂：称 以1.50克硫酸铜(CuSO45H2O )和6.0克酒石酸钾 钠 (KNaC4H4O64H2O),用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液， 用水稀释到1 升，贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存 瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。2. 器材：可见光分光光度计、大试管15 支、旋涡混合器等。（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取12 支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0

5、 毫升 的标准蛋白质溶液，用水补足到1 毫升，然后加入4 毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室 温（2025C）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支 试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标 绘制标准曲线。2、样品的测定：取23个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注 意样品浓度不要超过 10mg/ml。评价：采用 540nm 分光光度法测定。测定快速，但是灵敏度差，不精确。3、Folin酚试剂法（Lowry法）（一）实验原理 这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙 的配

6、制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理 与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin一酚试剂，以增加显色量，从而 提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质 中的肽键与铜结合生成复合物。Folin酚试剂中的磷钼酸盐一磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨 酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度 与蛋白的量成正比。Folin酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域 得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，

7、要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对 双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。 酚类、柠檬酸、硫酸铵 Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿 素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%）， 丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的 溶液，只须加浓碳酸钠氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅， 则必须提高碳酸钠氢氧化钠溶液的浓度12倍。进行测定时，加Folin酚试剂时要特别小心

8、，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但 上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin 一酚试剂加到碱性的铜一蛋白质溶液 中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20250mg。（二）试剂与器材1.试剂（1）试剂甲：（A）10克Na2CO3, 2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaC4H4O64H2O）。溶解于 500毫升蒸馏水中。（B）0.5克硫酸铜（CuSO45H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A） 与1份（B）混合，即为试剂甲。（2）试剂

9、乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO42H2O） ,25克钼酸 钠（Na2MoO42H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充 分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（Li2SO4）, 50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄 色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂 瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最 终的酸浓度为1N左右。（3）标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清清蛋白或g球蛋白，溶于蒸馏

10、水，浓度为2 50mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%NaCI溶液。2.器材（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管16支（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组， 分别加入0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用 水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（2 025C）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin酚试剂），同样立即混匀。 这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后

11、在室温下放置30分钟，以未加蛋白质 溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量 为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1 支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时， 1 分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲， 2分钟 后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1 支试管可立 即加入0.5毫升试剂乙，1 分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管， 余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测 一个样品。

12、进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表 格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最 下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20250微克），按上述方法进行操 作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在 一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的& 9、1 0试管。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的 蛋白质浓度。注意:由于各种蛋白质含有不同量的

13、酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质 而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。评价：显色后在700nm处采用分光光度法测试。测试灵敏度高，是较为常用的方法。4、 改良的简易Folin酚试剂法（一）试剂1.试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5N NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸钾和0.05% 硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。2. 试剂乙：与前面的基本法 相同。临用时加蒸馏水稀释8 倍。3. 标准蛋白质溶液：同基本法。（二）操作步骤测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1 毫升，室温放置10分钟后，试

14、剂乙改为4毫升。在55C恒温水浴中保温5分钟。用流动水冷却后，在660nm 下测定其吸光度值。改良的快速简易法，可获得与Folin酚试剂法（即Lowry基本法）相接近的结果。评价：原理与方法三Folin酚试剂法基本相同，采用化学反应显色后，在660nm处用分光光度 法分析。但更为快速简易。5、考马斯亮兰法（Bradford法）（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学 家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的 原理设计的。这种蛋白质测定法

15、具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应 用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰 G-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置 （Imax）,由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主 要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford 法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因 为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而 光吸

16、收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于 染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1 小时内保持稳定， 且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格 地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、 甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不 同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g

17、球蛋白为标准蛋白质，以 减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十 二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线 来测定未知蛋白质的浓度。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用g球蛋白或牛血清清蛋白（BSA），配制成1.0mg/ml和0.1 mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮兰G250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G250，溶于50ml 95% 的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸

18、，用水稀释至1升。2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支（三）操作方法1.标准方法（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分 别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0. 02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5. 0ml考马斯亮兰G250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈， 以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第& 9、10管。（2）加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm 处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG250试剂。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少 量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。评价：化学反应显色后，在595nm处用分光光度法测试。 目前灵敏度最高的蛋白质测定法。干扰物质少。用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，这是 任何一种方法都无法避免的问题。