PCR实验注意事项

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1、实验中的一些好习惯加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性一定要记着关水浴箱，切记切记多和大家讨论，同时多关注别人讨论的经验，这几乎是最快提高的捷径了所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180C的高温下干烤6hr或更长时间。2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不 能使用）。3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2室温 10min,然后用0.1% DEPC水冲洗，晾

2、干。4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37C处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的 DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22卩m滤膜过滤 除菌。5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。二、常用的RNA酶抑制剂1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）:是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团 组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。 它既可破坏细胞结构

3、使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物 质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）:从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA 酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。因为DEPc不加选择的修饰蛋白质和RNA，因此在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且它与一 些缓冲液（例如Tri）不能相容在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要

4、原因是核糖核酸酶 （RNA酶）的污染。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。研究人员造成的污染RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RNA实验时应勤换 手套。但DEPC能与胺和巯基反应，因而 含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理（一）动植物总RNA提取-Trizol法Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。 用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂 交，Poly（A）分离，体外翻译，RNase 封阻分析和分子克隆。1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-1

5、00mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总 体积不能超过所用Trizol体积的10%。2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心 管，用手剧烈摇荡离心管15秒。3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温 放置10分钟，12000g离心10分钟。4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4C下7500g 离心5分钟。5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA 的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可

6、55C-60C水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离，或 贮存于70%乙醇并保存于-70C。注意1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。另外，提取上清这步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然会有蛋白质污染，影 响比值2、加氯仿前的匀浆液可在-70C保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4C保存一周， -20C保存一年。总mRNA的提取（自己的经验）一、关于Trizol Reagent需要的试剂1. Chloroform：氯仿（分析纯）2. Isoproplyl alcohol:异丙醇（分析纯）3. 75% Ethanol （ in DEPC-treated w

7、ater） :75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用 0.01%的 DEPC 处理过的无Rnase的水稀释。4. RNase-free water:无 Rnase 的水。方法是：将 DEPC 按 0.01% （V/V）加在 d H2O 中 500ml （50ul），在37C过夜，并高压灭菌即得（150C 3小时）5. 一次性塑料手套6. 注意：DEPC有致癌之嫌二、关于Trizol Reagent的使用过程：1. Homogenization （匀浆）a. Tissues :组织每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂，样品体积不能超过Trizol试剂的10%。b. Cells Grown

8、in monolayer （单层细胞接毒后出现病变的）针对JEV细胞总RNA的抽提法：BHK21细胞长成单层后，接毒0.5-1ml （采用大瓶），37C吸附1h，倒掉，加维持液（含2%的血 清和HEPE8的MEM）约5ml,维持天。出 现75%-100%的病变时，以PBS （预冷）冲洗细胞两次， 直接在细胞瓶中加入Trizol试剂1ml/10cm2,吹吸几次，以裂解细胞（细胞瓶有两 种常用规格: 大的约45cm2，小的约30cm2，故所用Trizol试剂分别约为4.5ml和3ml。Trizol试剂的加入是 依细胞瓶而定，以盖满瓶底为度，而不是依据细胞的数量，否则可导致DNA的污染）具体方法 如

9、下：（样品一定要新鲜）（1）组织接入预冷的EP管中，加入Trizol试剂1ml/10cm2 （量一定要加足，否则易污染）， 混匀，吹吸几次，以破裂细胞，置室温5min，以使核蛋白复合物彻底分离。（2）加氯仿0.2ml （每1ml Trizol试剂加入氯仿0.2ml），盖好，剧烈震荡15s,置室温2-3 分钟。（3）4C离心，10000gX15min,离心后，混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、 上层为无色的水相。RNA包含在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%。（4）仔细吸取上层水相，移至另一 EP管中。（5）加0.5ml异丙醇，以沉淀RNA （每1ml Tri

10、zol试剂加入0.5ml异丙醇），置室温10min。（6）4C离心，10000gX10min。RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁。(7) 弃上清液，加入预冷的75%乙醇lml (每1 mlTrizol试剂加入75%乙醇至少lml)，震荡， 充分洗涤沉淀，4C离心，5500gX5min。弃上清液，空气干燥(或真空干燥)后，沉淀重悬于无 Rnase dH20中，吹吸几次，55C-60C作用10分钟以溶解RNA, -70C保存备用。(8) 抽提出的细胞总RNA干燥后加水50ul，取10ul加无Rnase水990ul,稀释100倍成1ml。 于0.5cm厚的石英比色杯中，以无Rnase水

11、为对照，在721型紫外分光光度计下检测，结果应为： A260/280 ratio1.6。(9) 分离组织10mg (纯组织)加800ul Trizol试剂。(10) 扩增产物的鉴定DEPC处理方法如下：1. DEPC处理(1) DEPC水：100ml超纯水加入0.2ml DEPC，充分混匀，高压灭菌。(2) Tip头(枪头)、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材(包括1ml、200 ul、 20ulTip头；EP管和PCR反应管等)：用0.1%的DEPC水(1000 ml超纯水加入1 ml DEPC)37C 浸泡过夜，高压灭菌。2. 提取RNA，用DEPC水溶解3. RT我是用P

12、CR仪来控制温度和时间的，所以RT是在PCR反应管中作的。4. 操作过程中要戴一次性手套，并经常换手套。最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水处理一下，枪头盒插好枪头后，加入1-2ml的0.1轕 C水，在灭菌就行了；现在有进口的RNASE FREE的枪头买，直接用不用处理的如何消除污染机器运行完后，取出PCR产物时不能随便丢弃，应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。(1) 试剂：mixer尽量分装，不要原瓶多次取用。(2) 加样：原则是DNA最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针 有多管的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后

13、再 分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染。另外，普通实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有 比较大的关系，最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。目前，国内外各个公司提供的诊断试剂盒大多采用了 UNG来防污染。Uracil-DNA N-glycosylase(UNG)尿嘧啶DNA糖基酶，来源于大肠杆菌重组克隆表达。RNA定量RNA也最好至少要用电泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度计比较不 同标本之间就更不准了。RNA的贮藏，最主要的是温度，一20不够，最好一80，液氮最保险mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有

14、翻译效率和RNA降解速度的影响RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来 发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR 的进行一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，半定量和定量RT-PCR做的都是基因相 对表达量，不是绝对表达量mRNA的分离与纯化中步骤（4）中将RNA溶液置65C中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的 二级结构，尤其是mRNA Poly（A）尾处的二级结构，使Poly（A）尾充分暴

15、露，从而提高Poly（A）RNA 的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合,否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不 能省略。下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。3）保温试验方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管 中，并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70C 的恒温水浴中，保温1 h。另一份放置在-20C冰箱中保存1 ho时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一 致或者无明显差别（当然，它们的条带也要

16、符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残 留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70C保温的样本有明显的降解，则说明RNA 溶液中有RNA酶污染。PCR污染与对策）PCR扩增产物污染这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，所以，扩增区的仪器什么如枪头 还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可 形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形 成气溶胶而污染据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别 重视的问题.1标本处理区，包括扩增摸板的制备；2. PCR扩增区，包括

17、反应液的配制和PCR扩增；3. 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备一PCR扩增一产物 分析f产物处理。切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶 胶的污染；操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即 可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度反应液污染可采用下列方法之一处理：1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I,室

18、温反应30 min后 加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA 的序列；（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常 为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。1、提取mRNA时所用的EP管、玻璃等器皿全部都要用0.1轕C水浸泡。然后烘干，高压灭菌， 再烘干。2、用DEPC水洗过后当然不能用双蒸水洗了。那你用DEPC处理还有什么意义呢？还要用双蒸水 洗吗？3、玻璃器皿干烤：180度，8小时或更长时间；小器皿也可以用少许氯仿处理一下。另外，铁制 品、研砵等也可倒上酒精直接烧。