临床蛋白电泳及进展

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1、临床蛋白电泳及进展分散介质中的带电粒子在直流电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳 （electrophoresis）。蛋白质为两性电解质，在不同pH溶液中带不同的电荷，从而在直流 电场中能够泳动，这就是蛋白质的电泳现象。1937年瑞典化学家Tiselius首先建立了蛋白 质的界面电泳技术，并成功地将血清蛋白质分成几个组分。从此以后，随着电泳技术的不断 发展，蛋白电泳成为蛋白质化学研究和临床实验诊断中必不可少的重要方法。目前电泳方法 可分为：自由界面电泳和区带电泳两大类。因区带电泳应用比较广泛，故本文将主要介绍蛋 白质区带电泳技术在临床实验诊断中的一些应用和研究进展。一、基本知

2、识1电泳的基本原理 不同物质的质点由于带电性质的不同，在一定的电场强度下移动的方 向和速度不同。如溶液中有一电荷电量为Q的粒子，在一定强度的电场中移动，设电场强 度为E,粒子的移动速度为v，v/E表示单位电场强度下带电粒子运动速度，称为迁移率（mobility），用M表示，它与粒子半径（r）,粒子的带电量（Q）,溶液的粘度（n）有 如下的关系：以上公式仅适用于球形粒子，许多生物大分子如蛋白质上带有可电离的基团，在溶液中离解 后形成的离子并非球形，因而实际测得的离子迁移率比以上公式算得的值要小一些。设d为粒子移动距离，t为电泳时间，电场强度E为单位距离内的电位差（AU）, L为两 电极间的距离，

3、则两物质A、B移动距离的差Ad为：由上式可知，物质A和物质B能否分离，取决于两者的迁移率。如果A和B的迁移率有足 够大的差别，将能彼此分开。2影响电泳的主要因素电场强度 电场强度也称电位梯度，它是指单位长度的电位降。电场强度对电泳起重要 的作用。电场强度愈大，则带电粒子的移动愈快。根据所用电场强度大小，可将电泳分为常 压电泳（100500V）和高压电泳（50010000V）。常压电泳分离时间长，多用于分离蛋 白质等大分子物质；高压电泳分离时间短，多用来分离氨基酸、多肽、核酸等小分子物质。溶液的pH值 溶液的pH值决定了物质的解离程度，也决定了带电粒子所带的净电荷。 溶液的pH值离等电点愈远，则

4、粒子所带的电荷愈多，电泳速度愈快。在分离某一蛋白质混 合物时，应选择适宜pH值，以利于各蛋白质组分的分离。为了使溶液pH值在电泳过程中 恒定，须使用缓冲溶液。溶液离子强度离子强度影响粒子的电动电位（E电位），不宜过高或过低，一般最适宜的离子强度在0.020.2mol/kg。电渗 在电场作用下液体对固体支持物的相对移动称为电渗。由于电渗现象往往与电泳 同时存在，所以带电粒子的移动同时受电渗影响。如电泳方向与电渗相反，则实际电泳的距 离等于电泳距离减去电渗的距离。在选择支持物时应注意尽量避免选用高电渗作用的物质。其它影响因素缓冲液的粘度，缓冲液与带点粒子的相互作用以及电泳时的温度变化等 因素也都影

5、响电泳的速度。二、基本技术概述1醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素是指纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯，由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维薄素薄膜。它具有电渗小、分离速度快、分离清晰、血清用量 少及操作简便等优点，现已广泛用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白和同工酶等的分 离和测定。2凝胶电泳凝胶电泳根据支持介质的不同可分为淀粉胶、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 电泳等。琼脂糖凝胶孔径较大，对蛋白质一般不起分子筛作用，适用于分离同工酶及其亚型， 大分子核酸等。聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛作用，有更高的分辨率，普遍用于分离蛋白质及 小分子核酸。3等电聚焦电泳(isoelectric focus in g,

6、IEF) 等电点是蛋白质的一个重要性质，测定等电 点的方法是在不同pH条件下测量蛋白质的电泳迁移率，然后用迁移率对pH作图，对应于 迁移率为零的pH就是蛋白质的等电点。按照蛋白质等电点不同而进行分离的电泳方法称为 蛋白质等电聚焦电泳。由于其分辨率可达到O.OIpH单位，故特别适用于分离分子量相近而 等电点不同的蛋白质组分。4.毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)毛细管电泳是八十年代初发展起来的一类高效、快速分离分析方法。同其它技术相比，毛细管电泳具有分辨率高、塔板数高、选择性 好、定量准确、所需样品少等特点。毛细管电泳将电泳载体移到毛细管中后，克服了传统电

7、泳的热扩散和试样扩散的难题，大大提高了分析的灵敏度。因而它是一种比传统电泳优越得 多的分离分析技术。毛细管电泳可分为毛细管区带电泳、凝胶电泳、等速电泳、等电聚焦和 胶束电动色谱等。在生命科学中广泛使用的是毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis, CZE)。毛细 管区带电泳是近年发展起来的一种高效、快速的液相分离分析技术，有分离选择性高、检测 灵敏度高、分离快速、操作简便和易自动化等特点，现已开始在临床实验诊断中得到逐步地 应用。三、临床应用及进展1血清蛋白电泳 人血清中含有一百种以上的可识别的蛋白质，这些蛋白质执行着许多重 要的生理功能。在各种疾病期间，血

8、清蛋白的总量和各个蛋白质组分的比例会发生改变，因 此血清蛋白的总量和各个蛋白质组分的分析在临床诊断上有很重要的意义。分析血清蛋白质各个组分变化最简单的方法就是血清蛋白电泳，采用醋酸纤维素薄膜或琼脂 糖凝胶作为电泳的支持介质，血清蛋白电泳能产生5条或6条区带。采用淀粉胶或聚丙烯 酰胺凝胶作为电泳的支持介质，由于它们的分子筛效应，其分辨率大大超过醋酸纤维素薄膜 或琼脂糖凝胶，血清蛋白电泳能产生25条以上的区带。有关调查显示，现在各临床实验室 血清蛋白电泳主要采用的是醋酸纤维素薄膜或琼脂糖凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果 复杂，难以解释，除特别的目的外很少用于临床。现在血清蛋白电泳在临床上主要用于

9、以下 几个方面：免疫缺陷病 免疫缺陷病时，IgG低下较常见，而IgM和IgA低下较少见，血清蛋白电 泳可粗略地判定IgG的量，严重的IgG免疫缺陷在血清蛋白电泳的y区带可发生明显变化，故可采用血清蛋白电泳排除igG免疫缺陷病。但这种方法不是十分可靠的，定量测定igG、 IgM和IgA有时是十分必要的。免疫应答 由于血清中IgG、IgM和IgA的量各不相同，多克隆IgG和IgA的量分别超 过20g/L和6g/L时，电泳时才能见丫区带发生明显区带扩散现象，而IgM在血清中的量较 少，电泳时不易见明显变化，故电泳只能反映出IgG和IgA参与的显著的免疫应答。单克隆免疫球蛋白血症 多发性骨髓瘤、淀粉样

10、变、巨球蛋白血症、浆细胞病和淋巴瘤 等在血浆中可能出现单克隆免疫球蛋白或其轻链，通过电泳可检测到这些异常分泌产物，在 电泳a-丫区带间出现M蛋白峰，有助于疾病的临床诊断。炎症炎症时急性时相反应的结果是电泳时a1和a2球蛋白增加，这种改变是由于急性 时相蛋白a1-抗胰蛋白酶和结合珠蛋白增加所引起的。但采用电泳法评价炎症时急性时相反 应变化，其敏感度低于直接测定C反应蛋白。补体激活区带电泳B2区带的C3由于补体激活后消耗而减少，但C3不稳定其含量可因标本保存时间延长而减少。所以，定量测定C3或其降解产物更为可靠。营养不良及肝脏疾病 营养不良及肝脏疾病可引起血浆中的某些蛋白质的减少。减少的 蛋白质主

11、要是白蛋白、前白蛋白、转铁蛋白和视黄醇结合蛋白。在临床上须注意鉴别的是， 以上这些蛋白在炎症的急性时相反应时合成都减少，白蛋白还可因血管的通透性增加而在血 液循环的过程中丢失。蛋白质丢失 血清白蛋白可由肾病综合征通过肾脏、烧伤病人通过皮肤和节段性肠炎通 过肠道丢失。血清白蛋白恢复至正常水平表示其病理状态的好转。在一些情况下，定量测定 白蛋白是有用的。血管内溶血排除炎症和急性时相反应后，血清结合珠蛋白减少是血管内溶血的较可靠 指标。然而还须注意，血清结合珠蛋白减少也可能是由于遗传性结合珠蛋白a链合成障碍 所引起。同电泳法相比较，定量测定血清结合珠蛋白是一种更可靠和灵敏的判定血管内溶血 的方法。血

12、浆蛋白的遗传性缺陷 临床上有诊断价值的血浆蛋白遗传性缺陷有Q-抗胰蛋白酶缺 乏病、血浆铜蓝蛋白缺乏病和C1酯酶抑制物缺乏病等，但实际上能通过血清蛋白电泳区带 电泳鉴定的血浆蛋白遗传性缺陷有白蛋白遗传性缺陷、a1-抗胰蛋白酶缺乏病和结合珠蛋白 缺乏病。2.血红蛋白电泳 现已发现超过700种由于血红蛋白结构异常而产生的血红蛋白病，其中 大多数为良性，并无临床症状。血红蛋白电泳是一种用了分析和确定异常血红蛋白的常用方 法。血红蛋白电泳是根据不同的血红蛋白所带的电荷不同而进行分离的，不同的电泳方法具 有不同的电场强度、pH值、缓冲液或支持介质。最常用的两种电泳是碱性缓冲液电泳和枸 橼酸酸性缓冲液电泳。

13、醋酸纤维素薄膜电泳是碱性缓冲液电泳最常用的支持介质，琼脂糖凝 胶是枸橼酸酸性缓冲液电泳最常用的支持介质。在pH8.4碱性醋酸纤维素薄膜电泳时，只能分离HbA、HbA2和HbF。HbC、HbE、HbA2和 HbO的电泳迁移率相似，HbS、HbD和HbG也一同迁移，故对不能以上血红蛋白组分进行分离。在pH6.2枸橼酸酸性琼脂糖凝胶电泳时，电泳可分离碱性醋酸纤维素薄膜电泳不能分离开的血红蛋白，可从HbE中分离HbC,从HbD和HbG中分离HbO和HbS。但采用两 种电泳法均不能区分HbE和HbO, HbD和HbG。等电聚焦电泳技术虽然费力和耗时，但它有有非常高的分辨率。等电聚焦电泳能较好地确定 和分

14、析异常血红蛋白，可从HbE中分离HbC，从HbD和HbG中分离HbO和HbS。除此以 外，HbA和HbF也可清楚地被分辨出来。而且，等电聚焦电泳产生的狭窄的Hb电泳区带 比传统电泳技术具有更高的精确度和准确性。毛细管区带电泳作为一种新发展起来的分离技术现也被用来分析变异血红蛋白，现已有毛细 管区带电泳用于分析异常HbA2和HbF报道。3尿蛋白电泳尿蛋白可能是早期肾损害的指标，尿蛋白电泳可用于鉴别蛋白尿的种类和 原因，估计肾损害的程度。I960年Bia in ly等首先提出了蛋白尿选择性的概念作为判断肾小球损伤严重程度的指标，判 断这种能力可通过电泳测定尿中的中分子量蛋白质和高分子量蛋白质的比值

15、来确定的。选择 性蛋白尿中蛋白质主要为中分子量（4万8万）的白蛋白、转铁蛋白、為微球蛋白等，而 分子量大于9万的蛋白质多不出现，提示病变未及肾小管，见于早期肾小球肾炎。非选择性 蛋白尿中大分子蛋白质和中分子蛋白质同时存在，提示肾小球滤过膜受损严重。临床上常采用醋酸纤维薄素薄膜或琼脂糖凝胶作为支持介质进行尿蛋白电泳，用于区别肾小 球和肾小管性蛋白尿。本周氏蛋白可通过电泳在溢出性蛋白尿中发现，并可通过免疫电泳进 一步鉴定出k或入轻链。聚丙烯酰胺凝胶电泳有更高的分辨率。聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛作用，蛋白质由于分子大 小的不同而得到分离，蛋白分子量为17X10370x103Da能被容易地分离出来，这可

16、用来 鉴定肾小球性蛋白尿同时伴有的肾小管性蛋白尿。未知蛋白质的分子量可与标准的分子量的 参照物比较而被得到估计，有学者报道采用这种方法判定肾移植病人环抱霉素A引起的肾 毒性。二维凝胶电泳技术（two-dimensional gel electrophoresis）也可用于蛋白尿的分析。第一维 电泳根据蛋白质的等电点的不同采用等电聚焦电泳分离蛋白质，第二维电泳根据蛋白质的大 小和所带电荷的不同采用聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质。可采用二维电泳分析了尿液中的蛋白 质，并进一步确定是区别肾小球和肾小管性蛋白尿。这种技术也被用于分析前列腺癌和类风 湿性关节炎的标志物蛋白质。4.脑脊液蛋白电泳以醋酸纤维素薄膜

17、或琼脂糖凝胶为支持介质，可进行脑脊液（CSF）的蛋白电泳。脑脊液进 预先浓缩适当倍数后，在醋酸纤维素薄膜上可分为6个组分：前白蛋白，白蛋白，a- a2、 B、y球蛋白。若采用琼脂糖为支持介质，还可见两个B组分，慢P2和快B。若要一般地了 解血脑屏障的通透性，醋酸纤维素薄膜和琼脂糖凝胶均可作为CSF蛋白电泳的支持介质。 高分辨的凝胶电泳已用于CSF蛋白的分析，二维电泳和细管电泳也已用于CSF的蛋白分析。由于血脑屏障对大小不同分子量蛋白质的渗透性不同，故在各种不同的病理状态下可见到一 些异常的CSF蛋白电泳图谱。前白蛋白增高见于脑萎缩、脑积水及中枢神经变性病。白蛋白增加见于脑血管病变、椎管阻塞。a

18、、p球蛋白增加见于脑膜炎、脑肿瘤。p增加可见与 动脉硬化、脑血栓等疾病。Y球蛋白明显增高见于脑肿瘤。CSF免疫电泳通常可指示血脑屏障渗透性异常的严重程度。CSF中的p-脂蛋白、IgA和口厂 巨球蛋白通常以痕量存在，p-脂蛋白、IgA和a-巨球蛋白的增高分别反映血脑屏障渗透性 高、中、轻度的增加。由于CSF蛋白电泳对人体疾病并不特异，因此在临床诊断上的应用受到限制。CSF电泳常 用于诊断多发性硬化症。在多发性硬化症中，CSF的IgG浓度时增加的，较早的方法是通过 蛋白电泳Y球蛋白的量来确定CSF中IgG的量，Y球蛋白几乎全是IgG。现在，定量测定 CSF中IgG的免疫化学法提供了一个更精确的定量方法。在诊断多发性硬化症时，除了测定 CSF中IgG浓度外，须注意CSF中是否出现寡克隆带和髓鞘碱性蛋白。在CSF电泳分析中， 在Y区可见稀疏的寡克隆带。寡克隆带代表严格异质性的IgG。CSF髓鞘碱性蛋白可通过 RIA的方法进行测定。综上所述，蛋白电泳在临床实验室诊断中起着十分重要的作用，蛋白电泳主要应用在血清、 尿液、血红蛋白和脑脊液等检查方面。现已有较新研究报道蛋白电泳用于泪液、唾液和头发 蛋白质分析。而且电泳技术方面的临床进展也日新月异，特别是毛细管电泳和二维电泳技术（见后附参考文献）。可以预见，蛋白电泳作为一种蛋白质的分析技术，将会越来越广泛地 应用于临床实验室诊断。