圣湘生物PCR新技术简介迪安培训行业分析

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1、高精度高精度PCRPCR检测肝病毒的现状及进展检测肝病毒的现状及进展湖南圣湘生物科技有限公司湖南圣湘生物科技有限公司 唐国政唐国政1峰谷书屋HBV慢性携带者（3.5亿慢性携带者）（分布）百分率 8%高度分布区乙肝病毒感染呈全球性分布2峰谷书屋中国是乙肝“大国”乙肝是我国一个威胁健康的严重问题乙肝是我国一个威胁健康的严重问题 每年有每年有3535万人死于乙肝病毒引起的肝脏疾病万人死于乙肝病毒引起的肝脏疾病其中其中1818万人死于乙肝病毒引起的肝癌万人死于乙肝病毒引起的肝癌1.21.2亿乙肝病毒携带者亿乙肝病毒携带者30003000万慢性乙肝患者万慢性乙肝患者3峰谷书屋“十一五十一五”重大传染病专

2、项计划病毒性肝炎重重大传染病专项计划病毒性肝炎重大研究专项启动大研究专项启动 2009年，我国病毒性肝炎领域最重要的进展是国家“十一五十一五”重大传染病专项计划重大传染病专项计划“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项启动（见表1）。这是“十一五”期间与“载人航天与探月工程、大型飞机”等相平行的16个重大专项计划之一。4峰谷书屋表1、国家中长期科技发展规划纲要（20062020年）确定的重大科技专项核心电子器件、高端通用芯片及基础软件新产品极大规模集成电路制造装备与成套工艺新一代宽带无线移动通信网高档数控机床与基础制造装备大型油气田及煤层气开发大型先进压水堆及高温气冷堆核电站水体污染

3、控制与治理转基因生物新品种培育重大新药创制艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治大型飞机高分辨率对地观测系统载人航天与探月工程5峰谷书屋HBV 复制周期(Replication cycle of HBV)6峰谷书屋7峰谷书屋主 题肝病毒PCR检测的临床需求及现状高精度肝病毒PCR检测技术介绍8峰谷书屋血清HBV DNA水平是临床上评价HBV复制情况的“金标准”HBV DNAHBV DNAHBV DNA贯穿感染者的终生贯穿感染者的终生ALT正常正常增高或者波动增高或者波动正常正常增高或者波动增高或者波动免疫耐受期免疫耐受期免疫清除期免疫清除期非活动或低非活动或低（非

4、）复制期（非）复制期再活动期再活动期肝组织学肝组织学无明显异常无明显异常,或或轻度炎症纤维化轻度炎症纤维化中度或严重炎症、纤中度或严重炎症、纤维化快速进展维化快速进展无炎症或仅有无炎症或仅有轻度炎症轻度炎症中度或严重炎中度或严重炎症、肝纤维化症、肝纤维化临床诊断临床诊断慢性慢性HBVHBV携带者携带者HBeAgHBeAg阳性慢性乙型肝炎阳性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化乙型肝炎肝硬化非活动性非活动性HBsAgHBsAg携带者携带者HBeAgHBeAg阴性阴性慢性乙型肝炎慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化乙型肝炎肝硬化Lok AS,et al.Hepatology.2009;50:661-662Liaw Y

5、F,Liver International,2009,29(s1):100-1-79峰谷书屋慢性乙肝病毒感染的自然史急性急性HBVHBV感染感染慢性携带者慢性携带者康复康复3050 年年慢性慢性乙肝乙肝稳定稳定进展进展肝硬化肝硬化代偿性肝硬化代偿性肝硬化肝癌肝癌死死亡亡失代偿肝硬化失代偿肝硬化(死亡）死亡）10峰谷书屋 N=3,774;p value for log-rank test,0.001Chen CJ et al JAMA 2006;295:65Iloeje U et al Gastroenterology 2006,130:678-68611峰谷书屋全球权威指南一致认为：乙肝治疗的

6、根本目的在于长期持续抑制病毒复制，阻止疾病进展 “持续抑制病毒复制，减轻肝脏炎症、坏死，从而延缓和阻断肝硬化和肝癌的发生”12峰谷书屋抗病毒治疗为什么需要长期？抗病毒治疗为什么需要长期？病毒很难除“根”cccDNA抗病毒治疗只是抑制病毒复制停药后，病毒“复活”，导致疾病反复、进展需要长期抗病毒治疗13峰谷书屋长期抗病毒治疗带来的益处抑制乙肝病毒复制，延缓疾病进展提高生活质量，延长存活时间调节乙肝患者的精神状态，减轻心理压力减轻家庭经济负担和家庭成员的负担14峰谷书屋目前常用的抗病毒药物目前常用的抗病毒药物:干扰素 普通干扰素 聚乙二醇干扰素-2a(PEG-IFN-2a)核苷(酸)类似物 拉米夫

7、定 阿德福韦酯 恩替卡韦 替比夫定等15峰谷书屋干扰素治疗有哪些优点和缺点？干扰素是通过调节机体免疫力达到治疗目的干扰素是通过调节机体免疫力达到治疗目的优点：优点：疗程固定疗程固定缺点：缺点：为注射制剂，使用不方便为注射制剂，使用不方便 降病毒能力不强降病毒能力不强 副作用较大副作用较大 禁忌症较多禁忌症较多 耐受率低耐受率低EASL Clinical Practice GuidelinesJournal of Hepatology 50(2009)22724216峰谷书屋核苷类药物治疗有哪些优点和缺点？核苷类药物直接抑制病毒复制核苷类药物直接抑制病毒复制优点：优点：降病毒快速、强效降病毒快速

8、、强效 为口服制剂，使用方便为口服制剂，使用方便 不良反应少不良反应少缺点：缺点：有耐药性有耐药性 疗程不确定疗程不确定EASL Clinical Practice GuidelinesJournal of Hepatology 50(2009)22724217峰谷书屋现有的抗病毒药物-干扰素拉米夫定阿德福韦酯、聚乙二醇干扰素等80年代90年代后期2005年后18峰谷书屋反应乙肝病毒载量金标准：乙肝病毒DNA检测HBV DNAHBV DNA：乙肝病毒脱氧核糖核酸，可直接了解乙肝病毒脱氧核糖核酸，可直接了解体内病毒载量和复制情况；并可用于判断抗病毒治体内病毒载量和复制情况；并可用于判断抗病毒治疗

9、的疗的效果。效果。19峰谷书屋2012：HBV DNA detection and HBV DNA level measurement are essential for the diagnosis,decision to treat and subsequent monitoring of patients(A1).Follow-up using realtime PCR quantification assays is strongly recommended because of their sensitivity,specificity,accuracy and broad dynam

10、ic range 3841(A1).2009：Recently,HBV DNA assays that utilize real-time PCR technology with improved sensitivity(5-10 IU/mL)and wider dynamic range(up to 8-9 log10 IU/mL)have become available乙肝治疗指南：美国和欧洲Hepatology,2009J Hepatol,201220峰谷书屋HBV DNA载量PCR检测的国际指南 谁需要检测：谁需要检测：HBsAg阳性患者和HBsAg阴性的高危人群 携带者、慢乙肝患者

11、、肝硬化和肝癌患者 什么时候检测：什么时候检测：未治疗患者、治疗前、治疗中、结束治疗后均需检测21峰谷书屋HBV DNA载量检测在治疗优化路线图中的作用22峰谷书屋HBV DNA载量检测在治疗优化路线图中的作用23峰谷书屋24峰谷书屋抗病毒治疗前病毒基线的准确测定抗病毒治疗前病毒基线的准确测定：适宜抗病毒治疗患者选择、抗病毒治疗方案的确适宜抗病毒治疗患者选择、抗病毒治疗方案的确定、抗病毒疗效的预测与后续疗效比对定、抗病毒疗效的预测与后续疗效比对抗病毒治疗过程中疗效的评估和方案优化、耐药抗病毒治疗过程中疗效的评估和方案优化、耐药突变检测和治疗终点的确认突变检测和治疗终点的确认抗病毒优化治疗停药后

12、随访及复发再治的判断抗病毒优化治疗停药后随访及复发再治的判断隐匿性病毒性肝炎的诊断隐匿性病毒性肝炎的诊断高精度核酸定量检测是保证乙肝患者走好抗病毒优化治疗之路的导航系统25峰谷书屋HBV DNA定量PCR检测的国际指南要求 超敏感（Hypersensitivity）HBV最低检测限10-15 IU/ml 宽线性范围（wider dynamic range）涵盖101109 IU/ml 高特异性（High specificity）可重复性好（Repeatability）（操作简单，或可自动化）26峰谷书屋HBV DNA 检测临床应用发展斑点杂交（Dot-blot hybridization）非定

13、量PCR（Non-PCR based quantitative HBV DNA assays定量 PCR-based quantitative HBV DNA assays1980s1990s2000s27峰谷书屋Abbott RealTime HBV1021041031051061071081010109101HBV DNA(IU/mL)HBV Digene Hybrid-Capture IHBV Digene Hybrid-Capture IIUltra-Sensitive Digene Hybrid-Capture IIAmplicor HBV MonitorCobas Amplicor

14、 HBV MonitorVersant HBV DNA 1.0Versant HBV DNA 3.0Cobas Taqman 48 HBVHBV PCR KitTMA Assay LLQ 5 IU mL进口进口HBV DNA PCRHBV DNA PCR试剂性能的比较试剂性能的比较28峰谷书屋29峰谷书屋我国某些RT-PCR乙肝试剂盒的灵敏度及线性范围现状：30峰谷书屋国产HBV DNA PCR试剂性能现状l 现有的国产试剂在检测灵敏度、线性范围、可现有的国产试剂在检测灵敏度、线性范围、可重复性等方面无法满足临床上日益增加的对重复性等方面无法满足临床上日益增加的对HBV HBV DNADNA定

15、量准确性和灵敏度的要求定量准确性和灵敏度的要求l 部分试剂缺乏内标，影响定量准确性部分试剂缺乏内标，影响定量准确性中华检验医学杂志，2012(无天、无地、无标、无法)31峰谷书屋32峰谷书屋33峰谷书屋HBV DNA定量使用低精度试剂的后果 临床实践中影响临床疗效的准确评估，从而使病人疗效出现偏差 临床研究中弱化抗病毒疗效34峰谷书屋主 题肝病毒PCR检测的临床需求及现状超敏感肝病毒PCR检测技术介绍35峰谷书屋磁珠法磁珠法在样本中加入超顺纳米磁珠，富集微在样本中加入超顺纳米磁珠，富集微量的病毒核酸分子，然后再扩增量的病毒核酸分子，然后再扩增36峰谷书屋37峰谷书屋乙肝病毒核酸提取不同技术比较

16、煮沸法煮沸法 柱提取柱提取 磁珠法磁珠法 操作复杂性操作复杂性 复杂复杂很复杂很复杂简单简单 核酸丢失核酸丢失很多很多多多少少污染环节污染环节 很多很多多多少少可重复性可重复性 很差很差 差差 好好 自动化程度自动化程度 手工手工 手工手工 可全自动可全自动 38峰谷书屋灵敏度达到灵敏度达到 10 10 IU/MLIU/ML低浓度样本（低浓度样本（10 IU/ml10 IU/ml）的灵敏度检测结果图（重复）的灵敏度检测结果图（重复9090次，检出率为次，检出率为100%100%）39峰谷书屋线性范围宽：线性范围宽：20 IU/ml 20 IU/ml2.00E+09 IU/ml2.00E+09

17、IU/ml40峰谷书屋重复性好，精密度高重复性好，精密度高批内批内(重复重复1010次测试次测试)、批间、批间(重复重复3030次测试次测试)Ct)Ct值变异系值变异系数（数（CVCV）均）均2%2%；浓度值对数值变异系数（；浓度值对数值变异系数（CVCV）8%8%41峰谷书屋抗干扰能力强，在高血脂、溶血、黄疸及药物抗干扰能力强，在高血脂、溶血、黄疸及药物治疗后等异常样本时，提高了检测的可靠性治疗后等异常样本时，提高了检测的可靠性42峰谷书屋操作简单，过程温和，提取快速。与其它方法操作简单，过程温和，提取快速。与其它方法相比，无需加热、无需高速离心、无需分离上相比，无需加热、无需高速离心、无需

18、分离上清液或磁珠颗粒清液或磁珠颗粒43峰谷书屋圣湘高精度HBV DNA试剂性能多中心评测 研究单位 负责人 中南大学湘雅医院 谭德明 中国医科大学盛京医院 窦晓光 南方医科大学南方医院 陈金军 初步报告，201244峰谷书屋研究方法 502份慢性乙型肝炎患者的血浆或血清样本(来自于三所医院的门诊和住院病人)，采集的标本-20-80低温冰箱保存，同时用Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan（CAP/CTM）HBV诊断试剂和湖南圣湘生物科技有限公司的磁珠法HBV DNA定量试剂进行检测。45峰谷书屋定量检测结果值（IU/mL）检测样本数（例）罗氏试剂检测结果圣湘磁珠法

19、试剂检测结果1.1E+0868535001.1E+08312319500100456910012577812153116合计635635圣湘磁珠法HBV DNA试剂与罗氏试剂比较研究结果46峰谷书屋圣湘磁珠法圣湘磁珠法HBV DNAHBV DNA试剂与罗氏试剂比较试剂与罗氏试剂比较研究结果研究结果 罗氏试剂盒与圣湘磁珠法试剂盒检测结果比较统计表 罗氏试剂盒与圣湘磁珠法试剂盒检测结果的一致性分析：阳性一致性百分比=468/472100%99.2%阴性一致性百分比=94/153100%61.4%总一致性百分比=（468+94）/635100%88.5%47峰谷书屋磁珠法磁珠法HBV DNAHBV

20、DNA检测试剂与罗氏试剂比较检测试剂与罗氏试剂比较研究结果研究结果 罗氏试剂盒与圣湘磁珠法试剂盒检测均有定量结果的样本共407例 两种试剂定量差异:1log10：386/407(94.8%)1log10罗氏：7份；罗氏圣湘：14份48峰谷书屋 两种试剂定量检测结果的散点图两种试剂检测结果的拟合优度情况（相关分析）（回归分析）常数项和系数的检验结果对检测均为阳性的样本，圣湘磁珠法试剂与罗氏试剂的定量检测结果具有线性相关，相关系数R=0.966；回归方程为：y=0.134+1.005x。磁珠法磁珠法HBV DNAHBV DNA检测试剂与罗氏试剂比较检测试剂与罗氏试剂比较研究结果研究结果49峰谷书屋

21、圣湘磁珠法其它磁珠法备注更换EP管无需更换更换2-3次操作简化操作简化从磁珠上将核酸洗脱 无需洗脱，磁珠/核酸复合物直接扩增加热洗脱，分离核酸无丢失核酸无丢失圣湘磁珠法与其它磁珠法病毒核酸提取差异50峰谷书屋品名灵敏度线性范围乙肝PCR试剂盒10 IU/ml202109 IU/ml丙肝PCR试剂盒25 IU/ml501108 IU/ml51峰谷书屋北京佑安医院北京首钢医院郑州大学第一附属医院河南科技大学第一附属医院河南省传染病医院石家庄传染病医院蚌埠医学院附属医院长征医院上海长海医院陕西省人民医院山西省人民医院佑安医院郑大一附院陕西省人民医院52峰谷书屋武汉协和医院湘雅一、二、三附属医院广东省

22、第二人民医院湖南省人民医院湖南省肿瘤医院郴州市第一人民医院福建医科大学第一附属医院重庆大坪医院超过300家三级医院湘雅医院武汉协和医院广州金域医学检验中心53峰谷书屋2012年6月25日，人民日报头版头条新闻：从“杂交水稻之父”袁隆平到以“高性能炭/炭复合材料”拿下空缺6年的国家技术发明一等奖的黄伯云，以及荣获美国“国家科技奖章”、拥有16项自主创新专利的戴立忠，一批科技领军人物在湖南涌现，一批后起之秀在湖南集聚。54峰谷书屋2010年，中组部部长李源潮关心公司发展55峰谷书屋改变，从现在开始56峰谷书屋解读基因，扩增健康解读基因，扩增健康57峰谷书屋标本类型 血清（2-3ML）最好是使用ED

23、TA抗凝全血标本，抗凝后6h内分离血浆。如使用血清标本，则需尽快（2h内）分离血清 不能用肝素、枸橼酸钠、草酸钾等抗凝剂58峰谷书屋标本运送快：标本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室或冰箱保存。低温：放在28临时保存运送。尤其是RNA样本，应在加冰条件下运送。生物安全：标本的运送还应考虑生物安全问题，应符合相应的生物安全要求。59峰谷书屋标本保存DNA样本：可在28下保存3d。RNA/DNA样本：在-20以下冻存1-2周。长期保存：-70以下冻存。60峰谷书屋四轮驱动，市场前景好四轮驱动，市场前景好 临床价值大临床价值大 收费空间高收费空间高 技术很领先技术很领先 发展成趋势发展成趋势61峰谷书屋