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1、第二章 组织学基础第一节 组织学技术简介Introduction of Histology,组织的概念,形态相似、功能相近的细胞与细胞间质结合在一起，形成组织。 动物体四类基本组织： 上皮组织 结缔组织 肌肉组织 神经组织,问题 解决方法 提高分辨率 显微镜 保持组织的原始构造 化学固定 透光 切片、涂片、铺片、磨片 增加反差 染色 区别不同生化成分 组织化学、放射自显影、 原位杂交 观察生活状态 培养,组织学技术简介,1.光镜技术（light microscope） 2.组织化学术（histochemistry） 3.电镜技术（electron microscopy） 4.放射自显影术（au
2、toradiography） 5.细胞培养术（cell culture） 6.组织工程（tissue engineering） 7.图像分析术（image analysis）,一般光镜技术中常用三种制片方法,涂片法液体材料，如血液、精液、各种分泌物、液体培养物等,铺片法易撕成薄片的材料，如疏松结缔组织,切片法将材料经处理后切成薄片,1.光镜技术,取材和固定 脱水和包埋 切片和染色 封片,普通组织切片制作过程,组织结构的立体形态与断面形态,材料块适宜大小（0.5cm3）,应用各种方法使组织标本尽量保持其离体前状态的过程称为固定。 固定的目的和机制： 使蛋白质凝固，终止或减少分解酶的作用，防止自溶
3、，保存组织、细胞的离体前结构状态，包括保存组织或细胞的抗原性，使抗原不失活，不发生弥散。 保存组织、细胞内的蛋白质、脂肪、糖原、某些维生素及病 理性蓄积物，维持病变的特异性特征。 使上述物质转为不溶解状态，防止和尽量减少制片过程中人为的溶解和丢失。 起助染作用。,固定（fixation）,物理学方法如低温冷冻，干冰（dry ice，即固态无水碳酸）冰冻真空脱水，石蜡渗入法。 化学方法采用各种化学溶液作固定液，使组织细胞进入固定状态。,固定方法,固定时间 小标本（如胃粘膜等）24h， 大标本应置放1224h。,常用固定液 10甲醛 中性甲醛液甲醛（浓）：120ml，水：880ml，NaH2PO4
4、H2O：4g， Na2HPO4：13g。 AF液 95乙醇：90ml，甲醛(浓)：10ml。,脱水：普通固定液大多是水溶液，必须先脱去组织内的水分，为浸蜡创造条件。脱水剂通常使用酒精。脱水的步骤是逐步升高酒精溶液的浓度，以去净组织块内的水分，最后完全由纯酒精取代。 10甲醛液固定后的组织块，脱水时应依次经过70、80、90、95酒精和无水酒精。 透明：因石蜡不溶于酒精而溶于二甲苯，因而组织块经脱水后须再用二甲苯置换出酒精。组织块浸入二甲苯后逐渐变得透明，故此步骤称为透明。透明时间根据组织块的大小及性质而定。,浸蜡：温箱（5860）内熔化的石蜡，将透明好的组织块置入，放置适当时间，使石蜡浸入组织
5、并替换出二甲苯。 包埋：在包埋器的内壁涂一层甘油，倾入熔化的石蜡，将浸透蜡的组织块放入包埋器，摆好间距和方位，俟蜡液表面凝固后，将包埋器投入冷水浴中，使石蜡冷却凝固。包埋后的组织蜡块，经过修整即可用于切片。,普通轮转式切片机,冰冻切片机,切片：在切片机上将包有组织的蜡块切成5-6微米的薄片。取下一段蜡带，置于涂布一层蛋白甘油的载玻片上，滴上适量水，于酒精灯上徐徐加温，至蜡片在水面展平，分离每张蜡片，倾去水，摆好蜡片位置，放入烤片箱。俟蜡片干燥并牢固地附着于载玻片后，即可取出，进行染色。,染色 染色的目的是使组织内的不同结构染上不同颜色以便于在显微镜下观察。 染色步骤（苏木精- 伊红染色法为例）
6、：,注：脱蜡后，若组织是用含汞的固定液（如Susa液、Helly液）固定，切片还须经含碘的70酒精脱汞后再入70酒精及蒸馏水。,普通染色法 即苏木精- 伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE染色法）： 苏木精为碱性染料，使染色质和核糖体着紫蓝色； 伊红为酸性染料，使胞质和细胞外基质着红色 嗜酸性（acidophilia)；嗜碱性(basophilia),HE染色，垂体远侧部,镀银染色：硝酸银神经细胞(黑),镀银染色，示小脑皮质神经元,醛复红与偶氮焰红染色，示肥大细胞和弹性纤维,醛复红与偶氮焰红染色,染色步骤（HE染色法为例）：,注：脱蜡后，若组织是用含汞的固定液
7、（如Susa液、Helly液）固定，切片还须经含碘的70酒精脱汞后复水。,封固 从二甲苯中取出切片，在切片的组织上滴加适量树胶，上面再加一盖玻片，使树胶布满于盖玻片与载玻片之间的间隙，封固即告完成。将封好的切片标本放入烤箱，待盖玻片粘着牢固后，即获得可供长期观察和保存的染色标本。,应用化学、物理、生物化学、免疫学或分子生物学的原理和技术，与组织学技术结合而产生，在组织切片显示某种物质的存在和分布状态。 分类： 一般组织化学术 免疫组织化学术 原位杂交术,.组织化学术（histochemistry）,一般组织化学术基本原理是在切片上加某种试剂，和组织中的待检物质发生化学反应，其最终产物或为有色沉
8、淀物，以用光镜观察，或为重金属沉淀，以用电镜观察。,一般组织化学术,糖,过碘酸,多醛,席夫试剂,紫红色反 应产物,例糖类： PAS（过碘酸希夫）反应，显示多糖和糖蛋白，呈紫红色,例酶类：酶与特异性底物的反应产物、再与捕捉剂反应，形成有色的沉淀物,联苯胺法：粒细胞和单核细胞中的过氧化物酶作用于过氧化氢，释放新生态氧，使无色的联苯胺形成蓝色沉淀。,过氧化物酶染色,例苏丹黑B(sudanblack B,SB)是一种能溶解于脂肪中的色素染料，可使细胞内的中性脂肪、磷脂和类固醇着色，即使细胞内微细结构的脂类物质也能显示出来。,苏丹黑B染色,组织细胞中脂滴呈橘红色，核呈蓝色,例4 油红O染脂类,例5 甲基
9、绿派若宁反应同时显示DNA与RNA,免疫组织化学（immunohistochemistry）,根据抗原、抗体特异性结合原理，用标记的抗体与组织中的抗原结合，标记物可于显微镜下观察，检测组织切片中的肽和蛋白质。 标记物有： 荧光素（荧光显微镜观察） 辣根过氧化物酶（光镜或电镜观察） 胶体金（多用于电镜观察）,免疫组织化学原理模式图,荧光素标记 毛细血管内皮细胞呈阳性,辣根过氧化物酶标记 胰岛B细胞呈胰岛素阳性,胶体金标记 金颗粒沉积在胰淀粉酶原颗粒部位,原位杂交术（in situ hybridization）,即核酸分子杂交组织化学术，检测基因（DNA片段）的有无、基因的表达活性（mRNA）,原
10、位杂交 脐静脉内皮细胞呈心房钠尿肽阳性,原理：用带标记物的已知碱基顺序的核酸探针与细胞内待测核酸按碱基配对原则进行特异性原位结合（杂交），并通过对标记物的显示而获知待测核酸的有无及相对量。 常用标记物有放射性核素和地高辛,用于观察组织细胞的超微结构 戊二醛、锇酸双重固定树脂包埋超薄切片（50-80nm 厚）电子染色（醋酸铀、柠檬酸铅） 根据电子束在不同结构上被散射程度的差异表现为电子密度高（黑或深灰色）和电子密度低（浅灰色）,透射电镜术 （transmission electron microscopy, TEM）,3.电镜技术,用于观察组织细胞表面构造，具有真实的立体感，无需制备切片,扫描电
11、镜术 （scanning electron microscopy, SEM）,概念：通过活细胞对某种放射性物质的特异性摄入，以显示该物质在组织和细胞内的分布、含量和代谢过程，借以反映细胞的功能状态,例 用3H标记的胸腺嘧啶核苷研究DNA合成和细胞增殖状态,4.放射自显影术（autoradiography）,5.细胞培养术（cell culture）,把从机体取得的细胞在体外模拟体内的条件下进行培养；培养组织块或器官则称组织培养术或器官培养术 用于研究细胞、组织的代谢、增殖、分化、形态和功能变化，各种理化因子对活细胞的影响 用相差显微镜观察,体外培养的HeLa细胞,体外培养的平滑肌细胞 （免疫组
12、织化学染色显示肌动蛋白）,6.组织工程（tissue engineering）,用细胞培养术在“体”外模拟构建机体组织或器官的技术。 研究包括四个方面： 种子细胞，即增殖旺盛的细胞，多为干细胞 细胞外基质，可用生物材料（如牛胶原）和人工合成高分子材料 构建组织或器官，即把细胞置于细胞外基质中进行三维培养、并形成所需要的形状 将构建物移植机体的方法 正在构建的有皮肤、软骨、骨、肌腱、骨骼肌、血管、角膜等；其中以组织工程皮肤较为成功，已成为商品用于治疗烧伤、皮肤静脉性溃疡等疾病,实验中的组织工程耳,7.图像分析术（image analysis）,图像分析术又称形态计量术（morphometry），
13、是应用数学和统计学原理对组织切片提供的平面图像进行分析，从而获得立体的组织和细胞内各种有形成分的数量、体积、表面积等参数,从量的角度显示结构与功能的关系。目前广泛应用的图像分析仪可快速准确地测量组织切片和电镜照片中的微细结构，通过软件程序获得各项数据；也可以测量组织化学染色切片，根据染色深浅而提供该物质含量的相对数值。,根据连续的组织切片应用计算机进行三维重建，以获得可供研究的微细结构的立体模型，这部分内容称为体视学（stereology）。,1 型(球形、椭球形和盘状)线粒体 2 型(杆状)线粒体3 型(不规则形)线粒体4 型(分支形)线粒体 5 型(出芽形)线粒体,线粒体三维重建模型,END,
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