Tan第二章基因工程的工具酶PPT课件

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1、9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 1,本课程内容,第一章 绪论 第二章 基因克隆的工具酶 第三章 基因工程的载体 第四章 目的基因的制备 第五章 目的基因导入和重组子的筛选 第六章 外源基因的表达 第七章 基因操作的基本技术 第八章 植物基因工程及应用 第九章 动物基因工程及应用 第十章 医学基因工程及应用,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 2,第二章 基因工程的工具酶,2.1 核酸酶 2.2 甲基化酶 2.3 连接酶 2.4 聚合酶 2.5 修饰酶,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 3,2.1 核酸酶 限制性核酸内切酶,2.1.1 限制性核酸内

2、切酶的类型 2.1.2 限制性核酸内切酶的命名法 2.1.3 限制性内切酶的识别序列 2.1.4 限制性内切酶的切割位点 2.1.5 限制性内切酶的切割方式 2.1.6 限制性核酸内切酶的反应体系 2.1.7 限制性核酸内切酶的星活性 2.1.8 限制性核酸内切酶对DNA的消化作用 2.1.9 限制性核酸内切酶酶切注意事项,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 4,几乎所有的生物都能合成自身所需要的酶，包括许多病毒。 酶参与所有生命活动过程，其在细胞内的分布、含量、活性等随生物生长、发育及外界条件的改变而改变。 Ribozyme：具有催化能力的RNA。酶不都是蛋白质。 定义：由活细

3、胞产生，能在体外和体内起同样催化的一类具有特殊空间结构的生物大分子，包括蛋白质和核酸等。,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 5,限制性内切酶（Endonucleosase）的发现,50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制修饰，它们由三个基因位点所控制：hsd R, hsd M, hsd S, 十年后，人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理： hsd R-限制性内切酶 hsd M-限制性甲基化酶 hsd S-控制两个系统的表达,9/26/2020,欢迎同学们听课

4、！,Slide 6,1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶，Hind II和Hind III，为基因工程技术的诞生奠定了基础。 截止到目前为止，已经分离出400余种II类酶，搞清识别位点的有300种，商品化的约有100种，而实验室常用的有20种 。,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 9,III类：识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。 2个亚基组成： Hsd M甲基化 Hsd R限制性内切酶功能 需要ATP、Mg2+，类似于 I 应用同样受限制。,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 10,II类：识别位点（回文

5、序列）严格专一，并在识别位点内将双链切断。因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶。 应用最广，酶最简单(Mg2+)，不需要特殊条件 具有两个亚基： Hsd M甲基化 Hsd R限制性内切酶功能 切割特异,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 11,2.1.2 限制性核酸内切酶的命名法,用属名第一个字母和种名的头两个字母组成的3个字母斜体的略语表示寄主菌的物种名以及菌株（型）的代号命名。该菌株（种）中发现的不同的酶按照顺序以罗马字母编号I, II, III等。如：Escherichia coli 用Eco表示。第四个字母代表菌株或株型、变种名，若酶存在于质粒上，则需大写字

6、母表示非染色体遗传因子。例：Hind III 从流感嗜血菌株（Haemophilus Influenzue）d 株中分离的第三个酶。EcoR I 表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上。,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 12,derivation： first three names from the latin names of the microorganism that produces them. first letter(genus), next two letters(species) writing：前三个字母用斜体，其他用正体表示。 如

7、果酶存在于一种特殊菌株中，三个字母后加上菌株名称符号,名称最后部分往往包含罗马数字,表示在该特殊菌株中发现这种酶的先后次序。,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 13,2.1.3 限制性内切酶的识别序列,识别序列 指限制性内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列 专一 通常46个特定的核苷酸对组成 迴文结构(palindromic sequence) 或旋转对称或二重互补对称,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 14,recognition sequence: cleave DNA symmetrically in both strands at short p

8、alindromic (symmetrical) recognition sequences to leave a 5-phosphate and a 3-OH. They leave blunt ends, or protruding 5- or 3-termini. EcoR: * 5G A A T T C 3 3C T T A A G 5 * ,recognition sequence enzymes 5 GTT AAC 3 Hpa blunt end 3 CAATTG 5 5 GAATTC 3 EcoR 5protruding end 3 CTTAAG 5 5 AAGCTT 3 Hin

9、d 5protruding end 3 TTCGAA 5 5 GGATCC 3 BamH 5protruding end 3 CCTAGG 5 5 CTGCAG 3 Pst 3protruding end 3 GACGTC 5,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 16,识别序列在DNA上出现的概率,1/4n（n识别序列核苷酸组成的数目） Sau3A 4 碱基酶, 则每隔256(44) bp会出现一个识别位点。 EcoR I、Pst I 6碱基酶，则每隔4096 (46) bp会出现一个识别位点。 Not I (8bp)= 1/48 65536，稀切酶 （rar cutters）:

10、 指识别序列长和识别序列富含GC或富含AT的限制性核酸内切酶。 仅是理论推测,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 17,同裂酶(isoschizomer)或异源同工酶:不同来源的限制酶可切割同一靶序列BamH I 和Bst I具有相同的识别序列GGATGC 同尾酶(isocaudiners)：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。两个同尾酶形成的黏性末端连接之后，一般情况下连接处不能够再被其任何一种同尾酶识别。如： BamH I 识别序列：GGATCC Bgl II 识别序列： AGATCT,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 18,远距离裂解酶(dist

11、ant cleavage)：识别位点与切割位置不一致。如： Faq I GGGAC (10/14) 5-GGGACNNNNNNNNNNNNNNNN-3 3-CCCTGNNNNNNNNNNNNNNNN-3 可变酶：识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的。如：BseJ I GATNNNNATC Subset酶：一种酶的识别序列包含于另一些酶的识别序列之中。如：Ehe I GGCGCC Hin6I GC GC,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 19,2.1.4 限制性内切酶的切割位点,切割位点：DNA在限制性核酸内切酶的作用下，两条链断开的位置。 一般在识别序列的内部或两侧附近。 以或

12、 表示。 环状DNA分子上某个限制性内切酶有n识别位点，完全切割得到n个DNA片段。 线性DNA分子，则会得到n+1个DNA片段。,Restriction digests digestion of plasmid or genomic DNA,for analytical or preparative purposes, using commercial enzymes and buffer solutions. All RE require Mg2+,usually at a concentration of up to 10mM,but different enzymes require

13、different pHs,NaCl concentrations or other solution constituents for optimum activity.,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 21,2.1.5 限制性内切酶的切割方式,交错切割（staggered cut）: DNA双链断开的位置对称地分布在识别序列中心位置的两侧，使切割后的DNA末端为单链突出的黏性末端。如：BamH I -GGATG C- -C CTACG- 平切割： DNA双链断开的位置处在识别序列的对称中心，使切割后的DNA末端为平齐的平末端。 如：Nsb I TGC GCA,9/26/2

14、020,欢迎同学们听课！,Slide 22,粘性末端 和平末端,粘性末端 (cohesive terminus/sticky ends)： DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。 3粘性末端： 3 突出的黏性末端（DNA末端的3端比5 长） 5 粘性末端： 5 突出的黏性末端（DNA末端的5端比3 长） 平末端（blunt ends）： DNA片段的末端是平齐的。,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 23,同尾酶（isocaudamer）,指来源不同，识别序列不同，但可以产生相同黏性末端的限制性内切酶。

15、 两个同尾酶形成的黏性末端连接之后，一般情况下连接处不能够再被其任何一种同尾酶识别。如： BamH I 识别序列：GGATCC Bgl II 识别序列： AGATCT,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 24,2.1.6 限制性核酸内切酶的反应体系,2.1.6.1 底物DNA 2.1.6.2 酶量 2.1.6.3 反应缓冲液 2.1.6.4 反应温度,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 25,2.1.6.1 底物DNA,进行大量酶切时，先要确定 RE 的浓度。一般 1U RE 于 37 条件下作用底物 DNA 1h 以上可切割 1 g DNA 。一般来说，要用 2

16、3 倍才能保证完全消化，对基因组 DNA 尤其如此。 酶切基因组 DNA 是否完全可通过紫外观察结果来判断，如看到 DNA 片段呈均一递减的一条区带，则表示酶切完全。,进行大量酶切时，先要确定 RE 的浓度。一般 1U RE 于 37 条件下作用底物 DNA 1h 以上可切割 1 g DNA 。一般来说，要用 2 3 倍才能保证完全消化，对基因组 DNA 尤其如此。 酶切基因组 DNA 是否完全可通过紫外观察结果来判断，如看到 DNA 片段呈均一递减的一条区带，则表示酶切完全。,水稻基因组的EcoR I酶切,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 26,2.1.6.2 酶量,根据酶的

17、活性和DNA底物的量而定。 限制性核酸内切酶活性单位定义： 在酶的最适反应条件下，在50l容积中，60分钟内完全切割1g DNA所需的酶量为1个酶活性单位（unit 或U） 与DNA分子上识别位点的密度有关： 密度大用酶量多；密度小用酶量少。,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 27,2.1.6.3 反应缓冲液,Tris-HCl or Tris-HAc MgCl2 or MgAc2 KAc or NaCl 二硫基苏糖醇(DTT) or -巯基乙醇(ME) 牛血清白蛋白(BSA) pH 7.58.0 at 37C,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 28,2.1.6.

18、4 反应温度和时间,大多数限制酶的反应温度为370C。 个别特殊的内切酶则需要在300C 、500C、600C或650C的温度下进行切割。 反应时间：一般在适宜的缓冲液和温度条件下，每微克DNA用15单位的酶，保温12小时。,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 29,2.1.7 限制性核酸内切酶的星活性,星活性（star activity）： 指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特异性的DNA片段的现象。 易产生星活性的内切酶用*标记。如：EcoR I*,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 30,引起星活性的原因：若使用

19、buffer不當, 會有star activity，而star activity是指限制酶對所作用的DNA及序列失去專一性, 當酶辨認切割位置的能力降低，導致相似的序列或是錯誤的辨認序列長度也會作用，而產生錯誤的結果。所以當DNA同時以兩種限制酶處理時，選擇可使兩種酶之活性反應均可達75以上的restriction buffer，若找不到適當的buffer則先加低盐的buffer使其中一酶作用後，在加入高盐buffer使另一酶作用，若無法以鹽的高低分別加入不同的buffer，則先加入一種buffer作用後，加3M NaOAc/95alcohol沉澱DNA，再加另一種buffer作用。,9/26

20、/2020,欢迎同学们听课！,Slide 31,2.1.8 限制性核酸内切酶对DNA的消化作用,单酶切: 加单一酶 双酶切:加两种酶 部分酶切: 一般通过控制酶切时间, 使DNA部分酶切 底物位点优势效应: 酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 32,2.1.9 酶切注意事项,选择正确的酶 DNA的纯度和浓度 反应体系甘油的量5%（酶保存在50甘油中，故所加酶液体积最多为酶切反应总体积的1/10）。 酶保存在200C；使用时在冰浴上操作。 反应体系各成分都加完后，再加酶。 每次取酶液用新的枪头，防止交叉污染。 酶切样品多时，可先取

21、一定量的酶液，稀释后再分装。 防止任何可能引起酶蛋白变性的因素，如：气泡、去污剂等。,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 33,2.2 甲基化酶,在专一位点上甲基化，与限制性内切酶相对应。 （一）大肠杆菌中的甲基化酶 dam甲基化酶: 可在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，这样可使一些识别顺序中含有5GATC3的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA如Bcl I（TGATCA），但BamH I（GGATAA）则不会因为N6A的甲基化而失去活性，因为这两种酶对底物的特异性不同。 dcm甲基化酶 此酶在序列5CCAGG3或5CCTGG3中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影响

22、的限制性内切酶是EcoR II。,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 34,（二） 甲基化酶在基因工程中用途许多II类限制性内切酶，都存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，封闭酶切位点，从而使其免受切割。如：M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的甲基转移到EcoR I识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使DNA免受EcoR I的切割。,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 35,2.3 DNA连接酶 (DNA ligase),2.3.1 E. coli 和T4 DNA连接酶 2.3.2 DNA片段之间的连接 2.3.2.1 具黏性

23、末端的DNA片段之间的连接 2.3.2.2 具平末端DNA片段之间的连接 2.3.2.3 DNA片段末端修饰后进行连接 2.3.2.4 DNA片段加连杆（linker）后的连接,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 36,2.3.1 DNA连接酶（DNA ligase）,来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，催化双链DNA片段紧靠在一起的3羟基末端和5 磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键。 用途：具有修复单链或双链的能力,在DNA重组、复制和损伤后的修复中都起关键作用。 提取：许多原核和真核生物及病毒中。,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 37,E. coli DNA lig

24、ase和T4 DNA连接酶,E.coli DNA ligase: Mr=74000, 作用于5端带磷酸基团的DNA底物 NAD+可促进该催化反应 分子克隆使用不多，亦不能连接RNA。 用途: cDNA第二链合成。,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 38,T4 DNA ligase: 一条多肽链(Mr=68000)，还可作用于 RNA,但效率低得多,需ATP作辅因子。日常用的最多。 T4 RNA ligase: 由噬菌体编码 催化单链DNA或RNA连接。 主要用途是对RNA进行3末端标记,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 39,2.3.2.1 具黏性末端的DNA片

25、段之间的连接,一般较好连接，直接加入缓冲液和T4 DNA连接酶就可以完成。,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 40,2.3.2.2 具平末端DNA片段之间的连接,连接效率较粘性末端低，尽量避免采用。加入缓冲液和T4 DNA连接酶就可以完成。,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 41,affecting factors,T：多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15以下,然而保持连接酶活性的最适温度却是37, 因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷。经常采用12.5（4-15）。 DNA concentrations：外源片段浓度比载体DNA浓度高10-2

26、0倍 防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体 time：O/N better,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 42,2.3.2.3 DNA片段末端修饰后进行连接,DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，也称人工接尾法：在末端核苷酸转移酶的催化下，在连接处的末端分别加上AAA，另一端加上TTT。 粘性末端修饰成平末端后进行连接：一端是粘端，另一端是平端。 DNA片段5端脱磷酸化作用后连接：防止自身连接环化。,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 43,2.3.2.4 DNA片段加连杆（linker）后的连接,连杆/衔接物（linker）：化学合成的812个核苷酸组成的寡核

27、苷酸片段。以中线为轴两边对称，其上有一种或几种限制性核酸内切酶的识别序列，酶切后可产生一定的粘性末端，便于与具有相同粘性末端的另一DNA片段连接。 衔接头/接头（adaptor）：化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制性核酸内切酶识别序列。其一端或两端具有一种或两种内切酶切割产生的黏性末端。 都具平末端的两种DNA片段的加连杆的连接 分别具平末端和粘性末端的两种DNA片段的加连杆的连接 分别具非互补粘性末端的两种DNA片段加连杆的连接,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 44,2.4 聚合酶,2.4.1 DNA聚合酶 2.4.2 反转录酶 2.4.3 RNA 聚合酶,9/26/2

28、020,欢迎同学们听课！,Slide 45,2.4.1 DNA聚合酶 (DNA polymerase),9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 46,2.4.2 反转录酶 (reverse transcriptase),依赖RNA的DNA聚合酶（RNA-dependent DNA polymerase） 最常见的商用反转录酶：来源于禽类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）。 AMV反转录酶具有反转录酶活性和RNaseH活性 反转录酶活性可以单链RNA或DNA为模板，以寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷olig(dT)或随机寡聚脱氧核苷酸为引物合成同模板

29、序列互补的互补链。但DNA指导的DNA聚合酶特性，不具有35外切酶活性，聚合时无校正功能。 RNaseH具有核酸外切酶活性，能以53或35方向特异地降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链。 最主要的用途：以mRNA为模板合成cDNA。,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 47,2.4.3 RNA 聚合酶 (RNA polymerase),以DNA为模板合成mRNA，不需引物，但必须有启动子。 常用的RNA聚合酶来源与SP3、T3和T7噬菌体。 用途：RNA探针的合成。,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 48,2.5 修饰酶,末端转移酶(terminal deoxy

30、nucleotidyl trasnferase/terminal transferase)：不依赖于DNA的DNA聚合酶，来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3端增加一个或多个脱氧核苷酸。 T4多核苷酸激酶(bacteriophage T4 polynucleotide kinase) (next page) 碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase):(next page) Topoisomerase改变共价闭合双链DNA分子的结构,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 49,T4多核苷酸激酶(bacteriophage T4 polynucleotide kinas

31、e)：,激酶:对核酸末端羟基进行磷酸化的酶。 用途： 放射性标记DNA链的5末端，探针标记 Maxam-Gilbert化学法的DNA序列分析；使缺少5磷酸的DNA片段和合成接头磷酸化。 该酶很难纯化,酶制品经常不纯。 铵离子是该酶的强烈抑制剂,处理前,DNA不能溶解于含铵盐的缓冲液中。 低浓度的磷酸也可抑制该酶活性。,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 50,碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase):,磷酸酶：去除核酸末端磷酸基团的酶。 细菌碱性磷酸酶(BAP)：E.coli中分离 牛小肠碱性磷酸酶(CIP)： 牛肠道分离，切除DNA、RNA和dNTP上的5磷酸基

32、团, 从DNA片段上除去5磷酸以防自身连接。 BAP活性更高, 对热和去污剂抗性更强,因此脱磷酸化后很难完全抑制BAP活性。 除去CIP可用蛋白酶K降解,nuclease 以核酸为底物的水解酶 按底物专一性分：RNase、DNase、非专一性核酸酶 按作用位点分：内切或外切酶 5-核酸酶或3-核酸酶 常用:BAL31核酸酶、S1核酸酶、绿豆核酸酶、RNaseA RNaseT1、DNase、外切核酸酶、噬菌体 外切核酸酶等。 许多核酸酶兼有内切和外切活性,核酸酶的分类 内切酶 非专一性 外切酶 3-核酸酶 核酸酶 内切酶 5-核酸酶 RNA 外切酶 专一性 非限制性 内切酶 限制性 DNA 外切酶,9/26/2020,欢迎同学们听课！,Slide 53,复习思考题,1.名词解释： 限制性核酸内切酶；回纹结构；同尾酶；同裂酶；黏性末端；平末端；限制性核酸内切酶的酶活性单位（U）；限制性核酸内切酶的星活性；连杆（linker）；衔接头（adaptor） 2. 限制性核酸内切酶反应体系的组成是什么？ 3. 引起限制性核酸内切酶星活性的可能因素有哪些？ 4. DNA片段之间的连接方式有哪些？ 5. DNA聚合酶、RNA聚合酶、反转录酶、末端转移酶、多核苷酸激酶和碱性磷酸酯酶有哪些主要特性？它们在基因工程中的主要用途分别是什么？,