党参总酮体外抗氧化活性的研究模板

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1、资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。学号: 按以下格式要求设计封面, 封面应该没有页眉( 四) 封面字体与字号要求如下: 学号 ( 黑体5号) 湖北民族学院本科生毕业论文( 设计) ( 宋体1号居中) 论文( 设计) 题目 ( 黑体2号居中) 院( 系) 名称 ( 宋体小3号) 专业名称 ( 宋体小3号) 学生姓名 ( 宋体小3号) 指导教师 ( 宋体小3号) 年 月 ( 宋体3号) 本科毕业论文党参总酮体外抗氧化活性的研究姓 名: 赵芬芳 班 级: 0711 1 专 业: 生物工程 指导教师: 姜宁 中国恩施二O一五年五月Std.ID: BACHELORS THES

2、IS OF HUBEI UNITroloxRSITY FOR NATIONALITIESAntioxidant activities of total flavonoids from radix codonopsis Faculty Name:School of Biological Science and technologyMajor:Biological engineeringStu-Name:Zhao fen fangMentor:Jiang Ning Enshi China日期? 郑重声明本人郑重声明如下: 1.本人所呈交的学士学位论文是在指导老师的指导下自己独立完成的。2.本所有点

3、材料, 实验和数据都是真实的 3.本论文中引用她人已经发表的成果、 数据、 观点等, 均已注明出处。 4.除本文中已经注明引用的内容外, 不包含任何其它已经发表或撰写过的科研成果。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名: 日期: 摘要目的: 研究党参总黄酮的体外抗氧化活性。方法: 以超氧阴离子自由基、 、 羟自由基、 ABTS自由基、 DMPD自由基、 DPPH自由基和过氧化氢的清除能力, 铁离子螯合力、 总还原力、 铁离子还原力为指标, 测定党参总黄酮体外抗氧化活性, 同时以EDTA-2Na、 VC和Trolox作为阳性对照。结果: 党参总黄酮体外抗氧化活性的结果表明, 超氧阴离子自由

4、基清除力为( 11.790.8) mol VC当量/mg,羟自由基清除力为( 0.580.02) mmol VC当量/mg, ABTS自由基清除力为(0.350.1) mol VC当量/g、 ( 0.040.01) mol Trolox 当量/g, DMPD自由基清除力为( 17.111.1) mol VC 当量/mg, DPPH自由基清除力为( 14.711.02) mol VC当量/mg、 ( 6.870.5) mmol Trolox当量/mg, 过氧化氢的清除力为( 95.46.5) mol VC当量/mg, 铁离子螯合力为( 10.480.8数据均保留小数点后两位。) mol EDTA

5、 当量/mg, 总还原力为( 125.312.7) mmmol VC 当量/mg、 ( 96.711.3) mol Trolox 当量/mg, 铁离子还原力为( 0.310.01) mol VC 当量/mg、 ( 6.590.6) mol Trolox 当量 /mg。结论: 党参总黄酮具有较强的体外抗氧化活性, 该研究为党参总黄酮进一步开发提供理论依据。关键字: 党参; 总黄酮; 体外抗氧化ABSTRACTObjective: To investigate the antioxidant activities in vitro of total flavonoids from Radix co

6、donopsis. .Method: Some antioxidant indexes in vitro To including superoxide anion free radicals, hydroxyl radicals, ABTS, DMPD, DPPH free radical and hydrogen peroxide scavenging, Iron iron ion chelating ability, the total reducing power, and Ferric ferric ion reducing power, were determination det

7、ermined of total flavones in vitro antioxidant activity of radix codonopsis pilosulae,ai the same timewhile EDTA-2Na, VC, and Trolox as were used as positive control. Result: In vitro antioxidant activity activities of total flavonoids from Radix Codonopsis showed that, superoxide anion radical scav

8、enging capacity( 11.790.80) mol VC Equivalent /mg, ; hydroxyl radical scavenging capacity( 0.580.02) mmol VC Equivalent /mg, ; ABTS free radical scavenging capacity (0.350.10)mol VC Equivalent /g、 ,( 0.040.01) mol Trolox Equivalent /g, ; DMPD scavenging capacity for ( 17.111.10) mol VC Equivalent /m

9、g, ; DPPH free radical scavenging capacity ( 14.711.02) mol VC Equivalent /mg、 ,( 6.870.50) mmol Trolox Equivalent /mg, ; hydrogen peroxide scavenging capacity for ( 95.46.50) mol VC Equivalent /mg, ; iron ion chelating ability for ( 10.480.8) mol EDTA Equivalent /mg, ; the total reducing power for

10、( 125.312.7) mmmol VC Equivalent/mg、 ,( 96.711.3) mol Trolox Equivalent /mg and, iron ion reduction for ( 0.310.01) mol VC Equivalent /mg、 ,( 6.590.60) mol Trolox Equivalent /mg.Conclusion: Total flavonoids of Radix Codonopsis exhibited strong antioxidant activity, the study provides a theoretical b

11、asis for its further development.Keywords: radix Radix Codonopsiscodonopsis; flavonoids; antioxidant activities目录1.前言11.1党参的介绍11.1.1党参地理分布11.1.2党参的化学成分11.1.3党参的药理作用11.2黄酮类化合物的介绍21.2.1黄酮类化合物的分类21.2.2黄酮类化合物的药理作用21.3抗氧化活性31.3.1体外抗氧化活性评价方法31.3.2体外抗氧化活性评价方法的原理31.4实验背景及意义52.实验材料与方法52.1.实验材料52.2实验试剂52.3实验仪

12、器72.4实验方法72.4.1溶液样品的制备和试剂的配制72.4.2芦丁标准曲线的测定92.4.3党参黄酮的提取与测定102.4.4 党参总黄酮体外抗氧化活性的测定102.4.4.1超氧阴离子清除能力的测定102.4.4.2过氧化氢(H2O2)清除能力的测定102.4.4.3羟自由基清除能力的测定112.4.4.4ABTS+清除作用112.4.4.5 DMPD+清除能力的测定112.4.4.6 DPPH清除能力的测定122.4.4.7铁离子螯合能力的测定122.4.4.8总还原力的测定132.4.4.9铁离子还原抗氧化力的测定132.5数据处理133实验结果133.1芦丁标准曲线测定结果133

13、.2桑枝黄酮提取率143.3 党参总黄酮体外抗氧化活性143.3.1超氧阴离子的清除能力143.3.2过氧化氢(H2O2)清除能力的测定结果143.3.3羟自由基清除能力的测定153.3.4 ABTS+清除能力153.3.5 DMPD+清除能力163.3.6 DPPH清除能力163.3.7铁离子螯合能力173.3.8总还原力173.3.9铁离子还原抗氧化力184讨论185结论196参考文献207致谢221.前言1.1党参的介绍党参(Radix codonopsis), 是中国传统中草药之一, 它有着悠久的历史。党参主要具有补气、 益血、 生津的功能, 主治脾肺气虚, 食少倦怠, 咳嗽虚喘, 气

14、血不足, 面色萎黄, 心悸气短, 津伤口渴, 内热消渴等症1。由于党参具有较高的利用价值, 对党参研究的人越来越多, 而是从各个方面对其进行了解, 使其发挥更大的功能, 为我们带来更多的益处。1.1.1党参地理分布中国作为世界党参的主产区和分布中心的国家, 拥有39种党参属植物, 就了解全世界也仅仅只有40余种。在中国药典所收载的党参是桔梗科植物党参Codonopsis pitosala (Franch.) Nannf或川党参Codonopsis tangshen Oliv的干燥根, 同属其它种类的根在局部地区亦作党参药用。由于野党参多为多年生植物无法满足市场的需要, 虽然其生长适应性强, 但

15、大都垂直分布在海拔12003300m之间, 因此市面上多使用栽培党参, 主产区山西多将党参栽培于海拔700m以上地区, 甘肃则多在1300m以上2。1.1.2党参的化学成分党参属药用植物, 含有丰富的化学成分。当前已分离并鉴定出来的有10种甾醇类, 21种糖苷类, 5种生物碱类及含氮成分, 34种挥发油成分, 13种三萜类及其它类成分, 还有多种人体必须的无机元素和氨基酸。例如, 从党参、 缠绕党参中分离到3个中性五环三萜化合物; 从川党参中分离得到党参苷、 党参苷、 党参苷、 党参苷和丁香苷5个新木脂素苷; 从寻甸党参(Codonopsis xundianensis)中分离鉴定了4个黄酮类组

16、分, 分别是柯伊利叶素、 苜蓿素、 汉黄芩素和木犀草素。其中, 柯伊利叶素、 苜蓿素和汉黄芩素3个黄酮组分均为从党参属植物中首次分离得到等等3,4。1.1.3党参的药理作用经过对党参化学成分的认识, 现代药理研究表明, 党参对人体许多方面都能带来不一样的效果: (1)对中枢神经的作用党参对中枢神经系统方面起到抑制作用, 张晓丹等发现党参水提物能延长传统催眠药戊巴比妥钠及麻醉药乙醚引起的睡眠时间, 表现出镇静作用。不但如此, 党参还具有促记忆、 改进学习记忆障碍的作用3,4。(2)对心血管系统的作用根据李丹明等对党参水煎剂的研究, 表明其对兔胸主动脉血管平滑肌条舒缩活动的影响, 结果证明党参对离

17、体血管肌条有舒张作用, 且此作用依赖于内皮细胞,可能是经过内皮细胞释放NO而产生的。不光如此, 党参还具有能够改进心肌代谢, 提高酶的活性的作用3,4。1.2黄酮类化合物的介绍黄酮类化合物( flavonoids) 是一类在自然界中广泛存在的化合物, 几乎所有的植物中都有, 她们常常以游离态或与糖结合成苷的形式存在。由于其分布极其广泛而且在植物中的含量较高, 因此它们是较早被人类发现的一类天然产物, 同时也是许多植物成分的活性化合物, 具有抗菌、 抗病毒、 抗氧化、 抗肿瘤等药理作用5,6。1.2.1黄酮类化合物的分类黄酮类化合物具有 C6-C3-C6的基本骨架, 根据中间三碳链的氧化程度、

18、B 环( 苯基) 连接位置( 2-或 3- 位) 以及三碳链是否呈环状等特点, 分为许多不同类型: 包括黄酮、 黄酮醇、 二氢黄酮、 二氢黄酮醇、 异黄酮、 二氢异黄酮、 查尔酮等化合物7。1.2.2黄酮类化合物的药理作用近年来, 研究黄酮类化合物的国内外学者, 越来越多。对其的研究也越来越深入, 这使得黄酮类化合物的应用也变得更加广泛。(1)抗氧化、 清除自由基作用据调查, 人类心脑血管疾病、 肿瘤、 老年性痴呆、 震颤麻痹症等疾病几乎都与氧自由基有关。然而传统的合成类抗氧化剂带来的副作用太大, 人们只能寻找其它的代替无, 此时多酚类物质中的黄酮类化合物因其分布广泛、 抗氧化性好、 毒副作用

19、小而受到大量关注8。以银杏叶为例, 其中黄酮类化合物含量较高, 具有提高免疫力, 抗癌防癌; 抗衰老和延长寿命等方面的作用9。 (2)抗哮喘作用 支气管哮喘( 简称哮喘) 是一种常见病、 多发病。全世界患哮喘的人高达3亿人之多, 中国约有3000万人, 因其死亡的每年差不多有20万人。其机制复杂, 而且是个长期用药的病, 对药物的毒副作用要求是很高的。据研究, 黄酮类化合物作为最安全的非免疫原性生物活性物质之一, 具有抑制炎症因子释放, 改进气道炎症; 改进肺功能, 降低气道高反应性等功能10。除此之外, 黄酮类化合物还有许多作用, 例如, 降血脂、 镇痛等作用11。1.3抗氧化活性抗氧化是指

20、抗氧化自由基的简称。现代医学研究表明, 衰老、 癌症、 心血管疾病、 炎症的产生与发展等都可由自由基及其代谢产物诱发, 化妆品中的自由基还会直接攻击人的皮肤, 从表皮细胞中抢夺电子, 使皮肤失去弹性, 粗糙老化, 因而研究抗氧化功能评价极其重要。抗氧化功能评价方法包括了体内评价和体外评价。由于体内研究费用高、 费时长, 因此现在采用更多的是体外评价。由于体外评价方法的增多, 我们能够将这些方法分为两类: 化学评价方法和生物活性评价方法12。1.3.1体外抗氧化活性评价方法根据抗氧化活性主要表现在抑制脂质的氧化降解、 清除自由基、 抑制促氧化剂( 如螯合过渡金属) 和还原能力等几方面的原理, 将

21、这些方法能够归为五大类: 以脂质的氧化降解为基础的方法; 以清除自由基为基础的方法; 以螯合过渡金属防止产生自由基的方法; 测定待测物的还原能力的方法; 其它方法。本论文采用了其中的三大类为基础, 进行了九个指标的研究。 以清除自由基为基础的方法: 以自由基的种类不同分为生物体中存在的自由基( 超氧自由基、 过氧化氢、 羟自由基等) 和人工合成自由基( ABTS自由基、 DMPD自由基、 DPPH自由基等) ; 以螯合过渡金属防止产生自由基的方法: 铁离子螯合能力; 测定待测物的还原能力的方法: 总还原力和铁离子还原能力的方法13。1.3.2体外抗氧化活性评价方法的原理 体外抗氧化活性评价的方

22、法有许多, 在此实验过程中, 本人使用了以下九中办法: (1)超氧阴离子清除能力 超氧阴离子自由基属于单线氧自由基, 它是经过邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化而产生, 体系颜色由无色变成浅黄、 黄色、 最后变成绿色, 加入抗氧化剂可抑制邻苯三酚自氧化, 使体系颜色加深变缓14。超氧阴离子的产生如图1.115: 图1-.1超氧阴离子的产生Fig. 1.1加上英文标注(2)过氧化氢清除能力 经过待测液对过氧化氢的清除能力进行分析。(3)羟自由基清除能力羟基自由基(OH) 是一种能够激发油脂过氧化反应的较强的氧化剂, 是生物细胞内反应活性最强的氧族自由基, 实验体系中, 过氧化氢在亚铁离子作用下生成羟

23、自由基, 向体系中加入水杨酸捕捉羟自由基, 同时产生在可见光区有特征吸收的紫色产物。在反应体系中加入抗氧化物质, 与水杨酸竞争捕捉羟自由基, 使生成的紫色产物减少, 溶液的吸光度发生改变15。图1-.2羟自由基的产生Fig. 1.2 同Fig. 1.1 (4)ABTS+清除作用 ABTS2,2 -azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6- suLphonate, 2,2 - 联氮- 二(3-乙基- 苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐 自由基阳离子清除实验是根据不同浓度受试物对ABTS 自由基阳离子溶液吸光度的影响测定天然产物对 ABTS 自由基阳离子的清除能力。ABTS 在氧化

24、剂的过氧化作用下形成一种亚稳态的自由基阳离子, 在抗氧化物质的作用下, ABTS 自由基阳离子被部分清除, 溶液吸光度降低15。 (5)DMPD+清除能力DMPD(二甲基对苯二胺)法, 在酸性条件下, DMPD被氧化生成稳定的DMPD+, 它在波长505nm处有最大吸收峰, 根据加入抗氧化剂后吸光度的变化可测得样品清除自由基的能力16。(6)DPPH自由基清除能力DPPH( 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine , 1,1- 二苯基-2-三硝基苯肼) 是一种在氮氮连接键上含有不对称价电子的氮族自由基。DPPH 自由基清除实验中, 受试物给出的氢原子与 DPPH 自由基结

25、合, 使反应溶液的吸光度发生变化15。(7)铁离子螯合能力 在多种金属离子中, 铁离子是最具有影响力的抗氧化剂, 能够促进脂质氧化作用进行。利用铁离子与菲咯嗪(Ferrozine)的复合物的呈色反应, 能够测得待测样品对铁离子的螯合能力。当样品螯合铁离子后, 后造成反应物在562 nm处的吸光度值降低。0D值越小, 反映待测样品的还原能力越强17。(8)用铁氰化钾还原法测定样品的总还原能力 该方法的原理为抗氧化剂所提供的电子能够使Fe3 +还原为Fe2+, 使体系溶液颜色改变, 反映出体系中氧化还原状态的改变。体系溶液吸光度值越大, 则表示被测物还原力越强, 抗氧化效果越佳14-15。(9)铁

26、离子还原抗氧化力 FRAP 法是以抗氧化物质具有很强的还原能力为理论基础的。反应体系中的Fe3 +在抗氧化剂作用下生成Fe2 +, 抗氧化物质的活性、 含量与Fe2 +的生成量成正比。适宜的条件下Fe3 +-TPTZ 被还原生成有色物质证明有抗氧化物质存在14。 1.4实验背景及意义 党参作为中国人传统用药中极其重要的一味药, 越来越受到人们的重视。当前对党参的研究大多还局限在它的应用, 如在羊日粮中添加党参药渣有利于减轻羊肉膻18: 党参发酵液能延缓疲劳的出现, 具有显著抗疲劳效果19, 对党参总黄酮体外抗氧化能力的研究尚少。本研究以超氧阴离子的清除能力、 过氧化氢清除能力、 羟自由基清除能

27、力、 ABTS清除能力、 DMPD清除能力、 DPPH清除能力、 铁离子螯合能力、 总还原力、 铁离子还原能力作为指标, 检测党参总黄酮的体外抗氧化活性, 为党参总黄酮的进一步开发提供理论基础。2.实验材料与方法章标题的段前为0.8行, 段后为0.5行; 节标题段前为0.5行, 段后0.5行; 标题以外的文字行距为”固定值”23磅, 字符间距为”标准”按以上的要求设计各级标题的段前段后距离2.1.实验材料党参购自湖北省金贵中药饮片公司2.2实验试剂试剂厂家芦丁国药集团NaNO2(亚硝酸钠)天津市福晨化学试剂厂Al(NO3)3(硝酸铝)天津市广成化学试剂有限公司NaOH(氢氧化钠)天津市风船化学

28、试剂科技有限公司VC(抗坏血酸)天津市光复科技有限公司Trolox(奎诺二甲基丙烯酸酯)东京化成工业株式会社Na2HPO4(磷酸氢二钠)天津市光复科技有限公司Na2H2PO4(磷酸二氢钠)天津市恒兴化学试剂制造有限公司KeFe(CN)6(铁氰化钾)天津市光复科技有限公司FeCl3(三氯化铁)天津市光复科技有限公司TCA(三氯乙酸)天津市光复精细化工研究所Tris(三羟甲基氨基甲烷)北京鼎国昌盛生物技术有限公司HCl(盐酸)信阳市化学试剂厂邻苯三酚(焦性没食子酸)天津市光复精细化工研究所DPPH( 1,1-二苯基-2-苦肼基)东京化成工业株式会社无水乙醇天津市光复科技有限公司EDTA-2Na(乙

29、二胺四乙酸二钠) 国药集团FeSO4( 硫酸亚铁) 天津市恒兴化学试剂制造有限公司菲咯嗪东京化成工业株式会社ABTS(2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)life science products & seniesK2S2O8(过硫酸钾)优耐德引发剂( 上海) 有限公司TPTZ( 2,4,6-三吡啶基三嗪) 阿拉丁DMPD(N,N-二甲基对苯二胺二盐酸盐)阿拉丁冰乙酸(冰醋酸)天津市光复科技有限公司水杨酸钠天津市光复精细化工研究所H2O2( 30%过氧化氢) 天津市恒兴化学试剂制造有限公司甲醇国药集团化学试剂有限公司无水乙酸钠天津市光复科技有限公司2.3实验仪器仪器厂家T

30、-1810北京普析通用仪器有限责任公司实验pH计梅特勒-托利多仪器( 上海) 有限公司旋蒸仪巩义市予华仪器有限责任公司GZX-9140 MBE数显鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司 RT-02A粉碎机 弘荃机械企业有限公司 酶标仪Tecan电子天平 上海精密科学仪器公司2.4实验方法2.4.1溶液样品的制备和试剂的配制(1) 芦丁标准溶液: 称取芦丁0.038 g, 用30%乙醇溶解定容至250 mL, 贴上标签备用。(2) 30%乙醇: 量取16 mL 95%乙醇放置50 mL容量瓶中定容至刻度, 贴上标签备用。(3) 5% NaNO3溶液: 称取5 g NaNO3放置于烧杯中溶解, 移至10

31、0 mL容量瓶中定容, 贴上标签备用。(4) 10% Al(NO3)3溶液: 称取10 g Al(NO3)3放置于烧杯中溶解, 移至100 mL容量瓶中定容。(5) 1 mol/L NaOH 溶液: 称取4 g NaOH加热水放置于烧杯中溶解, 移至100 mL容量瓶中定容, 贴上标签备用。(6) 2 mg/mL VC溶液: 称取0.2 g抗坏血酸放置于烧杯中溶解, 移至100 mL容量瓶中定容, 贴上标签备用, 再根据需要稀释到一定浓度。(7) 800 mol/l Trolox溶液: 称取0.02 g Trolox放置于烧杯中溶解, 移至100 mL容量瓶中定容, 贴上标签备用, 再根据需要

32、稀释到一定浓度。(8) 0.2 mol/L PBS( pH6.6) : 称取7.163 g磷酸氢二钠和3.112 g磷酸二氢钠, 分别用蒸馏水溶于小烧杯, 再将两溶液分别定容至100 mL的容量瓶, 摇匀。以3:5的比例取37.5 mL磷酸氢二钠溶液和62.5 mL磷酸二氢钠溶液, 在烧杯中混合均匀, 用pH计测定其pH, 用稀盐酸或氢氧化钠溶液微调pH至6.6, 贴上标签备用。(9) 1%铁氰化钾溶液: 称取1 g铁氰化钾放置于烧杯中溶解, 移至100 mL容量瓶中, 贴上标签备用。(10) 10%三氯乙酸: 称取10 g三氯乙酸放置于烧杯中溶解, 移至100 mL容量瓶中, 贴上标签备用。

33、(11)0.1%三氯化铁: 称取0.1 g三氯化铁放置于烧杯中溶解, 移至100 mL容量瓶中, 贴上标签备用。(12) 7 mmol/L邻苯三酚: 称取0.0088 g邻苯三酚试剂, 取10 mL纯水溶解于10 mL的EP管中, 摇匀, 贴上标签。需要注意的是, 由于邻苯三酚容易发生自氧化, 因此, 邻苯三酚溶液必须现配现用。(13) Tris-HCl缓冲液( pH8.2) : 称取1.5142 g Tris颗粒, 用蒸馏水溶解于小烧杯后转移至250 mL容量瓶, 蒸馏水定容。将已定容的液体移至烧杯, 加入浓盐酸不断搅拌, 用pH计测定其pH, 调节pH至8.2, 贴上标签备用。(14) D

34、PPH溶液: 称取0.394 g DPPH放置于小烧杯中加入10 mL无水乙醇溶解, 放入10 mL的EP管中, 贴上标签备用。需注意溶液必须现配现用, 避光保存。(15) EDTA-2Na溶液: 称取0.9306 g EDTA-2Na放置于10 mL的EP管中溶解, 贴上标签备用。(16) 2 mM硫酸亚铁溶液: 准确称取2.78 g硫酸亚铁放置于10 mL水的EP管中加入5 mL水溶解, 贴上标签备用。(17) 2 mM菲咯嗪溶液: 准确称取4.92 g菲咯嗪放置于放置于10 mL水的EP管中加入5 mL甲醇( 5 mM) 溶液溶解, 贴上标签备用。(18) ABTS储备液: 先配7 mM

35、 ABTS溶液, 称取0.0960 g ABTS粉末, 用蒸馏水溶解, 25 mL容量瓶定容, 贴上标签备用; 再配140 mM K2S2O8溶液, 称取0.3782g K2S2O8, 用蒸馏水定容至10 mL; 再次, 5 mL ABTS溶液加上88 LK2S2O8溶液, 避光保存过夜, 1216小时测定( 测定时, 用无水乙醇或0.1 M pH7.4的磷酸缓冲液稀释至734 nm处吸光值为0.70.02) , 贴上标签备用。需注意加入氧化剂后, ABTS+量减少, 吸收值降低, 因此要现配现用。(19) Ferric-TPTZ试剂: 300 mM pH3.6的醋酸缓冲液、 溶于40 mM

36、HCl 的10 mM TPTZ溶液、 20 mM的FeCl36H2O溶液按体积比为10:1:1混合(20) 10 mM DMPD溶液: 称取209 mg DMPD,溶于10 mL的去离子水中, 取10 mL溶液加入2 mL的0.1M pH6.3醋酸缓冲液, 再加入0.2 mL的0.05 M氯化铁中, 得到有颜色的自由基阳离子, 贴上标签备用。需注意, 该溶液要现配现用, 室温保存不超过12 h。(21) 6 mmol/L水杨酸钠溶液: 称取0.24 g水杨酸钠, 用水溶解, 之后定容至250 mL的容量瓶中, 贴上标签备用。(22) 6 mmol/L FeSO4溶液: 称取0.083 g Fe

37、SO4, 用水溶解, 之后定容至50 mL的容量瓶中, 贴上标签备用。(23) 6 mmol/L 过氧化氢溶液: 量取61 L 30%过氧化氢放入100 mL的容量瓶中稀释至刻度线, 贴上标签备用。2.4.2芦丁标准曲线的测定 将配制的芦丁标准溶液作为初始浓度。分别吸取1.0 mL、 2.0 mL、 4.0 mL、 6.0 mL、 8.0 mL标准品溶液分别加入标号为1、 2、 3、 4、 5的25 mL容量瓶中, 蒸馏水对照为0号瓶, 各加30%乙醇至12.5 mL。先加5%亚硝酸钠溶液0.7 mL, 震荡摇匀后放置6 min; 再加10%硝酸铝溶液0.7 mL, 摇匀后放置6 min; 之

38、后依次加入浓度为1 mol/L的氢氧化钠溶液5 mL; 最后用30%乙醇定容至25 mL, 放置15-20 min。0号作空白对照调零, 在510 nm波长下测量其余各瓶的吸光值(OD)。吸光值作为纵坐标, 浓度(mg/mL)作为横坐标, 绘制标准曲线图20。2.4.3党参黄酮的提取与测定称取党参粉末一定量, 按提取: 本实验说使用的党参黄酮, 是经过超声波提取法所提取的, 利用乙醇( 平均浓度在50%) 作为提取溶剂。乙醇体积分100 ,料液比1: 25( gm) , 提取温度70, 提取时间5 h条件进行提取。称取党参粉末0.5 g, 共12份, 分别装入同型号的试管中, 将试管编号, 之

39、后分别用浓度为0%、 10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 100%的乙醇提取, 料液比为1:20, 提取温度70, 水浴锅内水浴3h。水浴期间, 不时摇动试管。水浴结束后, 将样品提取液放入离心机中以3000rmin的转速离心30 min, 取上清液。吸收上清液4 mL于25 mL容量瓶中,测量不同料液比的样品中上清液中总黄酮的含量, 并计算提取率21-23。每个因素重复三次。样品中的总黄酮含量C为所测溶液的吸光度值带入回归方程计算出的黄酮类化合物浓度( mg/mL) ; V为提取液的体积( mL) 。提取率( ) M为样品质量(

40、 g) 2.4.4 党参总黄酮体外抗氧化活性的测定2.4.4.1超氧阴离子清除能力的测定采用邻苯三酚自氧化法, 在2.4 mLTrisHCl溶液( pH8.2) 中加入100 L不同浓度( 0 、 0.0625 mg/mL、 0.125 mg/mL 、 0.25 mg/mL 、 0.5 mg/mL 、 1 mg/mL 、 2 mg/mL) 的待测液, 混合后加入300 L浓度为7 mmol/L的邻苯三酚, 反应4 min后, 加入1滴浓盐酸终止反应24,25。以蒸馏水做参比用石英比色皿在325 nm处测定其吸光值, 三次重复, 结果以超氧阴离子清除率(%)P1表示: 其中A0为空白吸光度, A

41、1为待测液吸光度。2.4.4.2过氧化氢(H2O2)清除能力的测定取不同浓度的样品溶液0.5 mL加入到试管中, 再加入3 mL 用的0.1 M磷酸盐缓冲液( pH7.4) 配置的浓度为22 mMH2O2混匀后, 在230 nm处测吸光值26。以浓度为横坐标, 吸光值为纵坐标, 求出清除率(%)P2: 其中As为加H2O2的吸光值, Ac为不加H2O2的吸光值2.4.4.3羟自由基清除能力的测定 在标号的试管中首先加入1 mL浓度为 6 mol/L的硫酸亚铁溶液, 再加入2 mL浓度为6 mM的H2O2溶液, 加入2 mL不同浓度的( 0、 7.8125 g/mL、 15.625 g/mL、

42、31.25 g/mL、 62.5 g/mL、 125 g/mL、 250 g/mL、 500 g/mL ) VC溶液( 或待测液) , 加入1 mL浓度为6 mM水杨酸钠溶液, 摇匀, 37恒温水浴30 min后以纯水作参比于510 nm处测定各吸光值27,28。结果以羟自由基的清除率( P3) 表示: As: 硫酸亚铁+水杨酸钠+待测物+H2O2; Ar: 硫酸亚铁+水杨酸钠+待测物+水; A0: 硫酸亚铁+水杨酸钠+水+H2O22.4.4.4ABTS+清除作用(1)制备7 mM的ABTS+溶液, 避光保存( 现配现用) 。分别取0、 40、 80、 120、 160、 200 L ABTS

43、, 用去离子水补足200 L, 于734 nm处侧吸光值, 以ABTS浓度为横坐标, OD值为纵坐标, 建立标准曲线。(2)取100 L不同浓度的样品分别加入到96孔板中, 再加入ABTS+溶液300 L, 混匀静置10或30 min后, 于734 nm处测吸光值, 以100 L 50%乙醇溶液加入300 LABTS+溶液为空白29, 并测定100 L样品溶液+300 L无水乙醇的吸光值。按下列公式计算清除率( P4) 。A0: 100 L50%乙醇溶液+300 L ABTS+溶液后所测吸光值; At: 100 L样品溶液+300 LABTS+溶液后所测吸光值: Ac: 100 L样品溶液+3

44、00 L无水乙醇后所测吸光值2.4.4.5 DMPD+清除能力的测定取不同浓度的样品或阳性对照50 L加入96孔板中, 加入DMPD+溶液100 L,10 min后, 于505 nm处测吸光值30。以缓冲液的吸光值为空白, 做三组平行, 求清除率( P5) Ac为DMPD+初始浓度的吸光值; As为样品存在时的DMPD+吸光值2.4.4.6 DPPH清除能力的测定(1)DPPH标准曲线的制作制备0.1 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液, 避光保存( 现配现用) 。分别取0、 40、 80、 120、 160、 200 L DPPH, 用无水乙醇补足200 L, 于510 nm处侧吸光值, 以

45、DPPH浓度为横坐标, OD值为纵坐标, 建立标准曲线31。(2)样品DPPH自由基清除率的测定 分别吸不同浓度的样品浓度100 L, 置96孔板的微孔中, 加入100 L的DPPH溶液, 室温避光反应30 min, 同时以100 L DPPH溶液与100 L 50%乙醇溶液为空白, 在517 nm处测定吸光值31( P6) , 重复三次, 求平均值。按下列公式计算A0: 100 L50%乙醇溶液+100 LDPPH溶液后所测吸光值; As:100 L样品溶液+100 LDPPH溶液后所测吸光值; Ac:100 L样品溶液+100 L无水乙醇后所测吸光值 2.4.4.7铁离子螯合能力的测定吸取

46、50 L不同浓度( 0、 7.8125 g/mL、 15.625 g/mL、 31.25 g/mL、 62.5 g/mL、 125g/mL、 250g/mL) 的待测液( 样品或EDTA-2Na溶液) 分别加入到96孔培养板的孔中, 再加入5 L硫酸亚铁溶液(2 mM), 160 L去离子水, 室温需震荡反应5 min, 加10 L菲咯嗪溶液( 5 mM, 溶于甲醇) , 摇匀, 室温反应10 min后, 于562 nm处测定其吸光值32-33。进行三组平行实验, 结果以铁离子螯合率( P7) 表示: A0为空白吸光度; A1为样品吸光度; A2为不加菲咯嗪时的吸光值2.4.4.8总还原力的测

47、定 取2.5mL不同浓度的待测液( 样品或阳性对照) 按浓度不同(0、 7.8125 g/mL、 15.625 g/mL、 31.25 g/mL、 62.5 g/mL、 125g/mL、 250g/mL、 500 g/mL)加入标号的试管中, 依次加入2.5 mL磷酸盐缓冲液( 0.2 mol/L , pH6.6) 和2.5 mL1%六氰合铁酸钾溶液, 于50水浴保温20 min后, 快速冷却; 再加入2.5 mL10%三氯乙酸, 以3000 r/min离心10 min, 取上清液2.5 mL; 依次加入2.5 mL蒸馏水, 0.5 mL0.1%三氯化铁, 充分混合, 静置10 min后, 在

48、700 nm处测定吸光值34。吸光值越大表示还原力越强( 以蒸馏水作对比) 。重复三次。2.4.4.9铁离子还原抗氧化力的测定吸取10 L标准品或待测样品加入到96孔板中, 再加入300 L的ferric-TPTZ试剂, 混匀, 微板于37孵育, 30 min后, 于593 nm测吸光值35-36。2.5数据处理 所有实验均重复三次, 用Excel统计软件进行统计分析, 数据以平均数标准差( standarddeviation, SD) 表示。3实验结果3.1芦丁标准曲线测定结果 以芦丁浓度为横坐标, 吸光值为纵坐标, 绘制出芦丁标准曲线。如图3.1所示, 经计算, 回归方程为y=0.0083

49、x+0.0075,相关系数R2=0.9964。 图3.1芦丁标准曲线Fig.3.1 Standard curve Trolox of rutin3.2党参总黄酮提取率 采用料液比为1:25( g/mL) , 乙醇浓度100%, 提取时间5h, 提取温度70进行党参总黄酮的提取, 平均提取率为1.72%。3.3 党参总黄酮体外抗氧化活性3.3.1超氧阴离子的清除能力在一定范围内( 0.032 mg/mL) , 超氧阴离子的清除率与VC呈较好的量效关系结果见图3.2, 同时还能够看出超氧阴离子清除率也随党参总黄酮浓度增大而显著提高。将测得的党参总黄酮超氧阴离子自由基清除率代入超氧阴离子的清除率与V

50、C所形成的线性方程式( y=37.140+8.1467) 中, 得到党参总黄酮超氧阴离子自由基清除能力为( 18.722.12 ) molVC 当量后面类似的地方都要加上当量二字/mg 。图3.2党参总黄酮超氧阴离子清除能力Fig.3.2 Superoxide anion scavenging ability of total flavonoids from Radix codonopsis3.3.2过氧化氢(H2O2)清除能力的测定结果 在一定范围内( 0.0010.063 mg/mL) , 党参总黄酮和VC对H2O2均有清除能力, 且随浓度增大, 清除能力显著提高, 呈较好的线性关系, 结

51、果见图3.3。将测得的党参总黄酮H2O2清除率代入H2O2清除率与VC所形成的线性方程式( y=69.242+1.0452) 中, 得到党参总黄酮H2O2清除能力为( 95.46.5) mol VC/mg。图3.3党参总黄酮过氧化氢清除能力的测定Fig.3.3 hydrogen peroxide scavengingability of total flavonoids from Radix codonopsis3.3.3羟自由基清除能力的测定在一定范围内(0.0080.5 mg/mL), VC和党参总黄酮在一定范围内随浓度的升高而导致羟自由基的清除率升高, 如图3.4所示。将测得的党参总黄酮

52、羟自由基清除率代入羟自由基清除率与VC所形成的线性方程式( y=286.80x+10.887) 中, 得到党参总黄酮羟自由基清除能力为( 0.580.02) mmol VC/mg。图3.4 党参总黄酮羟自由基清除能力Fig.3.4 hydroxyl free radical scavenging abilityof total flavonoids from Radix codonopsis3.3.4 ABTS+清除能力 在一定范围内(0.332.6 g/mL), ABTS+清除能力随VC、 Trolox和党参总黄酮浓度的增大而增大, 呈良好的线性关系, 如图3.5所示。将测得的党参总黄酮AB

53、TS自由基清除率代入ABTS自由基清除率与VC所形成的线性方程式( y=0.1110x+1.6150) 中, 得到党参总黄酮ABTS自由基清除能力为 (0.350.1) mol VC/g; 同时将测得的党参总黄酮ABTS自由基清除率代入ABTS自由基清除率与Trolox所形成的线性方程式( y=0.8937x+1.3823) 中, 得到党参总黄酮ABTS自由基清除能力为( 0.040.01) mol Trolox/g。图3.5 党参总黄酮ABTS+清除能力Fig.3.5 ABTS+ scavenging abilityof total flavonoids from Radix codonop

54、sis3.3.5 DMPD+清除能力在一定范围内(0.0040.125 mg/mL), 随VC和党参总黄酮浓度的增大, DMPD自由基脱色反应越强, 这也说明抗氧化剂的抗氧化能力越强,如图3.6所示。将测得的党参总黄酮DMPD自由基清除率代入DMPD自由基清除率与VC所形成的线性方程式( y=0.0409x+17.253) 中, 得到党参总黄酮DMPD自由基清除能力为( 17.111.1) mol VC/mg。图3.6 党参总黄酮DMPD+清除能力的测定Fig.3.6 DMPD + removal scavenging ability of total flavonoids from Radi

55、x codonopsis 3.3.6 DPPH清除能力在一定范围内(0.0020.063 mg/mL), 党参总黄酮的DPPH清除能力始终高于VC的清除能力, 如图3.7所示。将测得的党参总黄酮DPPH自由基清除率代入DPPH自由基清除率与VC所形成的线性方程式( y=0.2420x+4.3435) 中, 得到党参总黄酮DPPH自由基清除能力为( 14.711.02) mol VC/mg; 同时将测得的党参总黄酮DPPH自由基清除率代入DPPH自由基清除率与Trolox 所形成的线性方程式( y=0.4508x+6.6046) 中, 得到党参总黄酮DPPH自由基清除能力为( 6.870.5)

56、mmol Trolox/mg。图3.7 党参总黄酮DPPH清除能力的测定Fig.3.7 DPPH scavenging ability of total flavonoids from Radix codonopsis3.3.7铁离子螯合能力 在一定范围内(0.0020.031 mg/mL), EDTA-2Na和党参总黄酮的铁离子螯合能力随浓度的增大而增大, 而且呈良好的量效关系, 而且党参黄酮的螯合力始终高于EDTA-2Na的螯合力, 如图3.8所示。将测得的党参总黄酮的铁离子螯合能力清除率代入铁离子螯合能力清除率与EDTA-2Na所形成的线性方程式( y=0.3612x+8.5952) 中

57、, 得到党参总黄酮铁离子螯合能力清除能力为( 10.480.8) mol EDTA/mg。图3.8 党参总黄酮铁离子螯合能力的测定Fig.3.8 iron ion chelating ability of total flavonoids from Radix codonopsis3.3.8总还原力在一定范围内(0.0040.133 mg/mL), VC、 Trolox和党参总黄酮的吸光值随浓度的升高而升高, 说明VC、 Trolox和党参总黄酮的还原力对浓度有一定的依赖性, 如图3.9所示。将测得的党参总黄酮的总还原力代入总还原力与VC所形成的线性方程式( y=1.1050x+1.7E-5)

58、 中, 得到党参总黄酮总还原力为( 125.312.7) mmmol VC/mg; 同时将测得的党参总黄酮的总还原力代入总还原力与Trolox所形成的线性方程式( y=0.0013x+0.0084) 中, 得到党参总黄酮总还原力为( 96.711.3) mol Trolox/mg。图3.9 党参总黄酮总还原力的测定Fig.3.9 Total reducing power ability of total flavonoids from Radix codonopsis 3.3.9铁离子还原抗氧化力在一定范围内(0.0020.125 mg/mL), VC、 Trolox和党参总黄酮的还原性随浓度

59、的增大而增大; 当浓度较低时, 三种物质的还原性相差不大, 如图3.10所示。将测得的党参总黄酮铁离子还原能力代入铁离子还原能力与VC所形成的线性方程式( y=0.0015x+0.2069) 中, 得到党参总黄酮铁离子还原能力为( 0.310.01) mol VC/mg; 同时将测得的党参总黄酮铁离子还原能力代入铁离子还原能力与Trolox所形成的线性方程式( y=0.0015x+0.142) 中, 得到党参总黄酮铁离子还原能力为( 6.590.6) mol Trolox /mg。图3.10党参总黄酮铁离子还原抗氧化力的测定 Fig.3.10. Ferric reducing antioxid

60、ant power ability of total flavonoids from Radix codonopsis 4讨论活性氧能够指机体内或者自然环境中由氧组成, 含氧而且性质活泼的物质的总称:主要有一种激发态的氧分子, 即一重态氧分子或称单线态氧分子(1O2); 3种含氧的自由基; ;2种过氧化物)以及一种含氮的氧化物等34。因此常见来研究体外抗氧化活性的方法之一是考察自由基的清除抑制能力, 再加上自由基能够分为天然自由基和人工自由基。以天然自由基为研究对象, 本研究检测了党参总黄酮超氧阴离子、 过氧化氢、 羟自由基三个指标的清除能力, 能够党参总黄酮和VC都对它们有较强的清除能力。卢化、 张义生等人对银木总黄酮也做了相同的实验37, 从过氧化氢清除能力党参总黄酮清除率达到了62.95.1%, 而银木总黄酮清除率能够达到59%; 而以人工自由基为研究对象, 本实验检测了党参总黄酮ABTS、 DMPD和DPPH自由基清除能力, 发现党参总黄酮对这些自由基均有较强的清除能力。由于自由基在生物体中无处不在, 是生命所必须的物质。在机体新陈代谢过程中, 自由基发挥着”利”和”害”双重作用。一方面, 其能有效防止感染, 对某些基因开启和关闭起调控作用等; 另一方面, 其又可攻击和氧化细胞及组织, 引发机体衰老, 增加心脏疾病、 中风、 癌症等发病的可能性。抗氧化剂具有显