食品检验工微生物基础

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1、食品检验工,微生物部分,目录,微生物检测基础知识 食品检测基础知识(微生物检验部分) 食品安全卫生基础知识 饮料中的致病菌、商业无菌进行测定 菌落总数测定 大肠菌群数测定 致病菌检测技术 检验结果的分析及检验报告的编写,一、微生物检测基础知识,1微生物学检验的范围 生产环境的检验 空气墙壁、地面及生产用水 原辅料的检验 主料、辅料、添加剂等 食品加工、储藏、销售环节的检验 对生产人员的卫生状况、食品加工工具、运输工具及包装材料等 食品的检验 出口食品、可疑食品及食物中毒食品,2 微生物学检验的指标 细菌菌落总数 细菌菌落总数反映食品的新鲜度、被细菌污染的程度及在加工过程中细菌繁殖动态的一项指标

2、 判断食品卫生质量的重要依据 大肠菌群数 作为人畜粪便污染的指标，评价食品卫生质量的重要依据 致病菌,3 微生物检验的要求 微生物检验室的基本要求 微生物学检验人员的要求 微生物检验程序的基本要求 培养基与试剂的基本要求 培养基的分类 培养基原料的质量控制,培养基的分类 据组成成分可分为:a合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。 b半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。c天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。按用途可分为a基础培养基：能满足各种微生物的营养需求加富培养基：加入某种微生物生长繁殖所需的营养物质，使其快速生长，便于分离b选择培养基：加入某种物质抑

3、制其他微生物生长，使目标微生物得到富集，便于分离c鉴别培养基：用来检测微生物的某些代谢特性 d 特殊培养基：加入一些特殊营养物质，如血清、血液等,培养基原料的质量控制 琼脂质量的控制 琼脂粉和琼脂条，一般为1.5-2% 蛋白胨的质量控制 胆盐的质量控制 选择性培养基选择应控制好 牛肉膏及酵母浸膏的质量控制 培养基性能的控制 染色液的控制 各种诊断血清的质量控制,3 微生物检验样品的采取及处理,样品采集的目的和要求 采集目的：准确评价食品的卫生状况，为保证食品质量、改进管理提供依据 采集的要求：必须有代表性 采样前应事先准备好灭菌的容器和采样工具，在无菌条件下，按照国家有关样品采集标准均匀而准确

4、地取样，使其具有代表性；同时采样必须妥善存放，严防污染或再污染；微生物学检验必须具有及时性，采集后的样品送到检验室越快越好，一般不超过3h，若路途遥远，可进行低温保藏；做好相应的记录。,4 培养基的制备,培养基配方的选定 同一种培养基的配方在不同著作中常会有某些差别。因此，除所用的是标准方法，应严格按其规定进行配制外，一般均应尽量收集有关资料，加以比较核对，再依据自己的使用目的，加以选用，记录其来源。 培养基的制备记录 每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养

5、基一同存放、以防发生混乱。 培养基成分的称取 培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于旁侧，每称完一种成分即在配方上面做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后，还应进行一次检查。,培养基各成份的混合和溶化 培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。最好使用不锈钢锅加热溶化，可放入大烧杯或大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在锅中溶化时、可先用温水加热并随时扰动、以防焦化、如发现有焦化现象、该培养基即不能使用，应重新制备

6、。待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分完全溶化，直至煮沸。如为琼脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后将两溶液充分混合。在加热溶化过程中，因蒸发而丢失的水分，最后必须加以补足。,培养基pH的初步调整 培养基的过滤澄清 培养基的分装 分装琼脂斜面培养基时，分装量应以能形成2/3底层和1/3斜面的量为恰当。分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的彻底灭菌。每批培养基应另外分装20ml培养基于一小玻璃瓶中，随该批培养基同时灭菌，以测定该批培养基最终pH之用,培养基的质量测试 每批培养基制备好以后，应仔细检查一遍，如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并

7、测定其最终pH。 将全部培养基放入361恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。 用有关的标准菌株接种1-2管或瓶培养基，培养24-48小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。 培养基的保存 培养基应存放于冷暗处，最好能放于普通冰箱内。放置时间不宜超过一周，倾注的平板培养基不宜超过3天。每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明显标签。,培养基的配制 （1）称量 按培养基的配方准确称取各成分，其中牛肉膏放在小烧杯里称量，其他成分放在称量纸上称量。 （2）溶化 用烧杯先装少许水,依次将药品倒入铝锅中，加足水，然后在电炉上加热溶化。

8、（3）PH值 用精密的PH试纸测定，并用1%氧化钠或5%盐酸调节到所需的PH值。 （4）过滤 趁热用纱布将培养基进行过滤。 （5）分装 过滤后根据不同需要，立即趁热装入试管或三角瓶等容器中。,注意事项 （1）不要使培养基沾在管口，如沾上，需用干净的纱布擦干净。 （2）液体培养基：分装高度以试管的1/4左右为宜。 （3）固体培养基：分装试管，其装量为管高的1/61/5灭菌后制成斜面。分装三角瓶容量之一半为宜。 （4）半固体培养基：分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后，垂直待凝成半固体深层琼脂。,（6）做棉塞 装好培养基的试管都要加上棉塞，这样既可过滤空气，避免杂菌侵入，又可减缓培养基水分的

9、蒸发，制棉塞的方法多种，形状各异，总原则如下： （1）用脱脂棉制作（脱脂棉花易吸水） （2）松紧适合 （3）塞头不要太大，一般为球状。 （7）包装 试管口或三角瓶口棉塞部分，用牛皮纸扎，以防灭菌时水蒸气打湿棉塞。,（8）灭菌 灭菌是指杀死物品上或环境中的所有微生物。 灭菌方法可分为四种：物理灭菌、机械灭菌、化学灭菌和生物灭菌。 物理灭菌：1、热力灭菌： 2、紫外光灭菌：一般应用于无菌室和接种箱的灭菌。,干热灭菌：适用于玻璃仪器，将物品放入烘箱，160170oC，12小时。 火焰灭菌：适用于常用用具，如接种环、镊子等。灭菌方法是放在火焰上直接灼烧。 湿热灭菌： (1)高压蒸汽灭菌：适用于培养基、

10、衣物等的灭菌。 （2）间歇蒸汽灭菌：适用于不耐高温的培养基或无高压蒸汽灭菌锅时。 （3）巴斯德灭菌：适用于牛乳类等不耐高温的物体。 紫外光灭菌：一般应用于无菌室和接种箱的灭菌。,高压蒸汽灭菌 高压蒸汽灭菌锅是一个耐高压又密闭的金属锅。它是利用在密闭条件下产生高压蒸汽来达到灭菌的效果。其温度在100oC以上，有强大的杀菌能力。因此它是一种用途广泛，效率高的灭菌工具。 分类：1、卧式 2、立式 具体操作步骤： （1）加入适量自来水于灭菌锅中（至水位线） （2）摆入上述包装好的待灭菌的培养基，注意：不要摆得太挤，以免影响蒸汽流通和灭菌效果。 （3）加盖旋紧螺旋，使蒸汽锅密闭不漏气（对角线均匀拧旋）,

11、（4）打开放气阀，打开电源，自开始产生蒸汽后10分钟（此时蒸汽锅内的冷空气由排气阀排尽）关紧放气阀，让温度随蒸汽压力上升而上升，当达所需压力时（15磅/时2）控制热源维持所需时间（30分钟）然后停止加热，让其自然冷却。 （5）待压力降至0磅时，打开排气阀，再打开锅盖，取出灭菌物。 注意：压力未降至0磅时，切勿打开锅盖，否则突然降压，招致培养基沸腾，沾湿棉塞，甚至冲出管外。 （6）自锅中取出灭菌好的培养基，放置稍冷却后摆成斜面，而后至37oC恒温箱培养24小时，无菌生长，方可保存备用。 应用此法灭菌是否彻底的一个重要关键是在压力上升之前，必须将锅内的冷空气完全排尽，否则虽然压力表已指15磅/时，

12、但锅内的温度还只有100oC，结果往往造成灭菌不彻底。,斜面摆放示意图：,无菌水的制备 用10ml量筒量取9.0的自来水，装入18*180的中号试管中，用100ml量筒量取99ml的自来水装入250ml的三角瓶中，做好棉塞，用牛皮纸包好，高压灭菌，备用。 移液管、培养皿的干热灭菌 （1）在移液管尾部塞上少许脱脂棉花，然后用报纸条包好。 （2）用报纸条包好干燥的培养皿。 （3）将已包好的移液管、培养皿放入电烘箱干热灭菌。干热灭菌是在恒温电箱中进行，它是利用高热空气来达到灭菌效果，因此称干热灭菌。适合玻璃器皿和金属用具的灭菌。带有胶皮的物品，含水份的物质，培养基等不可用这种方法。,操作步骤： （1

13、）将待灭菌物品包扎好，均匀放入烘箱内，注意不要摆的太挤，以免妨碍气流流通。 （2）打开鼓风机、开启电源，当温度100oC时，关闭通气孔，调温度至160oC，借恒温调节器的自动控制调节器，保持此温度12小时。 （3）中断电源，待温度降至70oC以下时，打开箱门，取出灭菌物品。,1)实验前，无菌室应打开紫外线灯灭菌30分钟以上,实验中应穿工作衣帽. 2)严格无菌操作，接种针、接种环在使用前后都必须火焰灼烧。 3)实验前后用75%（v/v）酒精对手消毒。 4)沾有病原微生物的器材，应置于指定地点。废弃物应用5%苯酚浸泡。,5 显微镜的使用,罗伯特虎克观察 到的细胞,罗伯特虎克制造的显微镜（1665）

14、,列文虎克和他的显微镜（约1680）,1680荷兰人A. van Leeuwenhoek成为皇家学会会员，一生中制作了200多台显微镜和500多个镜头。他是第一个看到活细胞的人，观察过原生动物、人类精子、鲑鱼的红细胞、牙垢中的细菌等等。,普通光学显微镜,相位差显微镜,位相差显微镜相差显微镜是能将光通过物体时产生的相位差（或光程差）转变为振幅（光强度）变化的显微镜。人的眼睛只能鉴别可见光的波长（颜色）和振幅的变化，不能鉴别相位的变化。但是大多数生物标本高度透明，光波通过后振幅基本不变，却存在相位的变化，人的眼睛感觉不到。19世纪30年代德国物理学家泽尼克首先设计并于1942年制造了第一台相差显微

15、镜，能将这种看不见的相位变化转变为看得见的振幅变化，由于此项发明，泽尼克于1953年获诺贝尔奖。相差显微镜主要用于观察活细胞，不染色的组织切片或缺少反差的染色标本。,解剖显微镜,此种显微镜放大倍率为4X至40X或更高，其倍率虽然不高，但是可以观察不透明的物体，因为光线是物体表面反射入镜，与复式显微镜不同，使用时用两眼观察，可观察到立体物像，且可边观察边解剖。,扫描式电子显微镜SEM,透射式电子显微镜,1、透射式电子显微镜1932年，德国科学家用电子替代可见光制成，其解像力是人眼的10000倍，放大倍率达250000倍或更多。使用穿透式电子显微镜的标本需要非常薄，(7.5-15nm)。 2、扫描

16、式电子显微镜扫描式电子显微镜的电子束不穿过标本，所以标本无需切片处理，而代之在标本表面涂上一层铂金，当电子撞击标本表面各点时，便产生次及电子，呈现立体状态，可观察标本的形状及表面的特征。,显微镜基本构造,普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一为机械装置，一为光学系统。 机械装置 显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋等部件 （1）镜座 镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系 统部件的基础。 （2）镜筒 镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与物镜（装在转换器下）间的暗室。,（3）物镜转换器 物

17、镜转换器上可安装34个接物镜，一般是三个接物镜（低倍、高倍、油镜）。转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。 （4）载物台 载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。 （5）推动器 是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，在纵横架杆上刻有刻度标尺。,（6）粗动螺旋 是移动镜筒调节物镜和标本间距离的机件 （7）微动螺旋 用粗动螺旋只可以粗放的调节焦距，要得到最清晰的物象，需要用微动螺旋做进一步调节。微动螺旋每转一圈镜筒移动0.1毫米。 光学系统

18、 由反光镜、聚光器、物镜、目镜等组成，光学系统使物体放大，形成物体放大像 。,显微镜基本操作 a、 观察前的准备 （1）显微镜的搬运 显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。 （2）显微镜的放置 将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约10cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。 （3）调节光的强度 接通电源，可利用灯光通过反光镜来调节光强度。 b、观察 （1）低倍镜观察 将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用调节旋钮慢慢下降载物台，直至物像出现直到物像清晰为止。

19、用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。,（2）高倍镜观察 在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。 （3）油镜观察 先用粗调节旋钮将载物台下降，并将高倍镜转出；在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油；用调节旋钮将载物台缓缓地上升，使油镜浸入香柏油中；用调节旋钮调至最清晰为止；观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油。 3、显微镜的保养 （1）观察完后，移去观察的载玻片标本。 （2）用过油浸镜的，先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭23次，再用擦镜纸将二甲苯擦去。 （3）转动物镜转换器，将目镜呈现八字放置与载物台错开。 （4）将载物台下降到最

20、低位置。,香柏油,调节时，要侧视显微镜,注意！,整个过程，油镜都不能离开香柏油！,显微镜的使用,1 测微 细菌和酵母细胞很小，肉眼直接看不到，不可能直接用尺去测量。它们的大小测量是应用显微镜测微尺。测微尺包括两个部分：目镜测微尺和镜台测微尺,目镜测策尺是一块圆形玻片，在玻片中央刻有一小尺。是在5mm内作50等分刻度的。另一种规格是5mm作100等分刻度的（如图所示）。目镜测微尺每一格实际代表的长度随使用目镜子和接物镜的放大倍数而改变，因此在测量微生物大小前必须用镜台测微尺进行校正。 镜台测微尺是在一块载玻片中央的小尺，它是在1mm内作100等分刻度的每一等分格为0.01mm，即10m。是专为校

21、正目镜测量尺刻度的每格长度而用的。,目镜上面的透镜旋开，把目镜测微尺放在目镜的光阑上，刻度朝下，然后把目镜的透镜放上，最后把目镜套入镜筒内。 把镜台测微尺放在显微镜载物台上，使刻度朝上。（先用低倍物镜，光线不要太强。对好焦距，将镜台测微尺移至视野中央并能看到刻度线），然后转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器定位，使两尺重迭，再使两尺的“0”刻度重迭。定位后，仔细寻找两尺之间另一个重迭的刻度。计算两个重迭刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。（因为镜台测微尺的刻度（每格为10um）是镜台测微尺上长度的实际度量），由下列公式可以算出所校正的正在使用的目镜测微尺每格长

22、度。 两个重迭刻度间镜台测微尺的格数10 目镜测量微尺每格长度（m）= 两个重迭刻度间目镜测量尺的格数 用同法分别校正在高倍镜、油镜下正在使用的目镜测微尺各格长度记录好。,二、食品检测基础知识(微生物检验部分),食品从生产加工到销售的整个过程中，有很多情况和因素均可促使食品腐败变质并具有毒性，而且可能使食品产生毒性的有毒物质多种多样，食品被污染的方式和程度也很复杂，因而腐败变质食品对人体健康造成的危害也表现不同。 一是引起急性中毒。 在一般情况下，常引起急性中毒，轻者多以急性胃肠炎症状出现，如呕吐、恶心、腹痛、腹泻、发烧等，经过治疗可以恢复健康；但重者可出现呼吸、循环、神经等系统症状，抢救及时

23、可转危为安；如贻误时机还可危及生命，有的急性中毒，虽经千方百计治疗，但仍给中毒者留下后遗症。,二是慢性中毒或潜在性危害。 有些变质食品中的有毒物质含量少，或者由于本身毒性作用的特点，并不引起急性中毒，但长期食用，往往可造成慢性中毒，甚至可以表现有致癌、致畸、致突变的作用。食用腐败变质、霉变食物除了可以引起急性中毒外，还具有极其严重的潜在危害,1食品被微生物污染后对人体的危害,自然界有许多微生物存在，其中有少数微生物对人类、动物或植物有病害作用，这类微生物就称为病原微生物，也可称它为致病微生物，或简称致病菌。 在自然界中除了少数能引起人体病害的病原微生物存在外，还有大量的、种类繁多的、非致病的腐

24、生微生物存在，其中一部分微生物在一定的条件下，可以引起食品变质。,引起人类病害的微生物有多种，其中一部分是因侵入消化道而引起疾病的，与食品卫生有关的致病菌基本上就是这一类的病菌。 在引起食品变质的微生物中，有些还能产生对人体有毒害的物质，当人体误食含有大量腐生微生物的食品或含有微生物毒素的食品后，就会发生不同程度的中毒。能在食品中产生毒素的微生物，多见于细菌和霉菌。,食品被微生物污染后对人体的危害可分为三种：细菌性食物中毒（常见的食物中毒）、真菌性食物中毒、消化道传染病。各种致病菌引起人类症状如下： 沙门氏菌：主要有伤寒，食物中毒和败血症等等。（急性胃肠炎症状） 金黄色葡萄球菌：侵入人体伤口会

25、产生化脓性感染，恶心、多次呕吐、腹痛。 致病性大肠杆菌：腹泻,消化道传染病是传染病中的一大类疾病，是由于食用了被微生物或寄生虫污染了的食品而发生的传染性疾病。这种传染病的病原菌具有很强的致病力，仅少量病原菌即可引起疾病的发生，并且人与人之间可以直接传染。细菌性痢疾、伤寒及副伤寒、霍乱等。,2食品微生物检测,食品微生物检测就是应用微生物学的理论与方法，研究食品中微生物的种类数量、生理特性、活动规律及其对人和动物健康的影响。,1）菌落总数的检测意义 食品可能被多种类群的微生物所污染，并在其中进行繁殖，食品中含有微生物数量的多少，可反映出食品被污染的程度如何，食品中细菌数越多说明食品的污染愈严重，愈

26、不新鲜，细菌数少，说明卫生质量好。,菌落总数(依据方法GB/T4789.2-2010食品卫生微生物学检验 菌落总数测定 ) ：食品检样经过处理，在一定条件下培养后(培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等)，所得1ml(g)待测样品中所含菌落的总数。(GB/T4789.2-2010)单位cfu/ml(g) 所的结果只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。目的是为了判定食品被污染的程度。,2大肠菌群的检测意义 在评价食品的卫生质量，也采用大肠菌群作为粪便污染的指标细菌，以含大肠菌群的多少作为依据。如大肠菌群数越多，表示受粪便污染的程度越大，受肠道中病原菌污染的可能性越大。,3

27、食品微生物的检测项目,大肠菌群(依据方法:GB/T4789.3-2003食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定 ) 大肠菌群:一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。依据方法:GB/T4789.3-2003 食品中大肠菌群数以100g(ml)检样内大肠菌群最大可能数表示,霉菌的检测意义 霉菌和酵母菌及其检验酵母菌是真菌中的一大类，通常是单细胞，呈圆形,卵圆形、腊肠形或杆状。 霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。,霉菌和酵母也可造成中腐败变质。由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等。由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等。,因此,霉菌和酵母菌也作为评价卫生质量的指示菌,并以霉菌和酵母计数来判定食品被污染的程度.,