影响凝胶色谱的分离的因素及其改进方法

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1、 影响凝胶色谱的分离的因素及其改进方法吴承志 张宁 封树林 孙振鹏（西南大学药学院，重庆，400716）摘 要：凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱 法又称分子排阻色谱法。凝胶色谱主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫 学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。关键词：凝胶色谱；影响因素；填料；改进方法Influence factors of the separation

2、 gel chromatography and improving methods Wu chengzhi Zhang ning Fengshuling Sun zhenpeng（College of Pharmaceutical Sciences, Southwest University, Chongqing 400716）Abstract: Gel chromatography was developed in the early sixties a quick and simple separation techniques, because the equipment is simp

3、le, easy to operate, does not require organic solvents, the polymer material has a high separation efficiency. Also known as gel permeation chromatography molecular exclusion chromatography. GPC is mainly used for classification of polymer molecular weight and molecular weight distribution of the te

4、st. Has now been biochemistry, molecular biology, biological engineering, medicine, molecular immunology and related fields widely used, not only used in scientific experimental research, and has a large scale for industrial production.Keywords: gel chromatography; Influencing factors; Packing; Impr

5、ovement methods凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和

6、水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。凝胶色谱主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对勿子质量分布测试。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。1 凝胶色谱的分离效果的因素 主要影响的因素有色谱柱填料的孔径大小及其粒径分布均匀性，其次是流动相、色谱柱高度、色谱柱的直径以及个人操作等。1.1首先，填料的孔径大小一定要合适，孔径太小，待测物不易流出，分析时

7、间长，展宽严重；孔径太大则很可能导致组分分不开。在做凝胶色谱时，需要先大致估计下待分析物的分子量，然后选择合适的柱子，如果不知道粒径，可先用大孔径的先试试，接着再用小粒径的以达到更高的精度。市售的柱子上都有该柱适用的分子量范围，一般选待测物分子量在色谱柱的最大分子量的20%-80%为宜。凝胶的颗粒粗细与分离效果有直接关系。一般来说，细颗粒分离效果好，但流速慢；而粗颗粒流速快，但会使区带扩散，使洗脱峰变平而宽。因此，如用细颗粒凝胶宜用大直径的层析柱，用粗颗粒时用小直径的层析柱。在实际操作中，要根据工作需要，选择适当的颗粒大小并调整流速。1.2其次是流动相。凝胶色谱中流动相的影响不像别的色谱（如反

8、相or离子色谱）那么明显。其中主要影响的是流动相的流速，一般流速越大，出峰越快，但分离效果可能不是很好。1.3其次是色谱柱的高度和直径。一般来说，色谱柱越长，样品组分分的越开，但过长时会消耗太多的溶剂，而且柱展宽等也容易变的严重。色谱柱直径太大时，样品沿径向的分布容易不均匀，容易出现柱中心处比柱四周跑的快，从而增加了展宽。1.4个人操作。这点在全手动操作的柱色谱中影响较大，对半自动的则影响较小。主要要注意加样时一定注意保证样品各组分在同一个“起跑线”上“起跑”. 而凝胶色谱中的凝胶采用合成葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 、琼脂糖凝胶等有机凝胶，这些有机凝胶的胶质软，机械强度低，填料的粒度一般用37

9、-75 。色谱柱长12尺以上，柱径7.8毫米，流速通常用1毫升/分。在这些条件下，一次实验时间往往需要三小时。加快流速会降低分离效率，因为凝胶色谱是一个由扩散控制的分离过程，高分子在溶液中扩散较慢，这就必然使流速受到一定限制。最终导致凝胶色谱的处理量小，时间长，分离效果不佳；分子尺寸相同的混合物（如异构体的混合物）不易分开2 改进方法 最近凝胶色谱的大量研究工作仍是多方面的，其中仪器、填料、检测方法的研究、以及色谱理论等方面的进展是和整个液体色谱的进展相关的。 2.1 填料 填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，柱压越大，柱压的增加限制了粒度小于3um的填料应用。在相同选

10、择性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是唯一的因素。 凝胶色谱填料合成技术的进展主要在下面四个方面：填料的微球化、窄粒度分布多孔硅微球的合成成功、小孔径多孔硅微球合成成功以及新的硅微球表面化学改性的发展。这些新发展的无机凝胶填料机械强度高，粒径小，可达到较高的柱效，孔容大，分离范围广，使用寿命长等优点，下面是一些填料的介绍：硅胶基质填料 以硅胶为基质的高效亲水凝胶色谱填料，多以甘油醚基( 即二醇基)进行硅胶的表面修饰 ，氨基、咪唑基、尿素及取代尿素等也 可 作 为 其 亲 水 基团 。为提高其表面的亲水性和生物相容性，将葡聚糖接枝在硅胶表面， 以分离蛋白质； 但使 用最广泛的仍然是二醇基， 这

11、与二醇基填料合成简 单且生物相容性好等特点不无关系。以硅胶为基质的色谱填料因表面游离的硅羟基具有弱阳离子交换作用，对极性化合物和离子型化合物都有一定的非特异性吸附，所以不能直接用作多肽和蛋白质分离分析用的凝胶过滤色谱填料，需要键合亲水官能团才能成为亲水性凝胶过滤色谱填料。在亲水凝胶色谱中，多选用硅烷化试剂作为配基进行修饰，以产生亲水性的二醇基，其反应如下： 且该填料也在相关实验中证实：其分离度要比一些有机凝胶要好，而且该填料也表现出很好的机械强度，稳定性和保持着很好的抗压能力，相比时间上也缩短了不少。2.2 检测方法的研究 检测方法也是色谱学研究的热点之一，人们不断更新检测器的灵敏度，使色谱分

12、析能够更灵敏地进行分析。人们还将其他光谱的技术引入色谱，如进行色谱质谱连用、色谱红外光谱连用、色谱紫外连用等，在分离化合物的同时即行测定化合物的结构。色谱检测器的发展还伴随着数据处理技术的发展，检测获得的数据随即进行计算处理，使试验者获得更多信息。如今又很多应用了，例如凝胶色谱净化浓缩联用仪在毒物分析中的应用；利用凝胶渗透色谱-激光光散射联用技术(GPC-MALLS)测定医用高分子材料的分子量及分子量的分布；凝胶色谱与紫外吸收分析仪联用技术分离青霉素G中抗原性高分子杂质等等，相信凝胶色谱联用技术会越来越广泛的得到应用。2.3仪器 通过与其他仪器联用，解决凝胶色谱法测定高聚物分子量分布从相对法向

13、绝对法过渡。测定高聚物分子量分布是凝胶色谱最重要的应用。试样先根据分子体积(即分子量)分离后再检测各组分的分子量及含量。在凝胶色谱中试样的分离是在色谱柱中进行的，被分离后的组分在流出柱子时就同时连续地用浓度检测器和分子量检测器分别检侧各组分的浓度和分子量，把两个检测器的输出讯号用记录仪记录后即得反映分子量分布的凝胶色谱曲线。过去由于没有比较灵敏和瞬时响应的分子量检测器，因而利用一组不同分子量的标样来标定色谱柱，然后从分子量淋出休积的标定曲线来作数据换算。这种用相对方法来检测分子量虽然暂时解决了问题，但是随之而来的是实验工作量增加以及数据处理方法上存在困难。实验数据的可靠性在很大程度上决定于标定

14、曲线、标样分子量数值以及数据处理方法的可靠性。其中色谱柱分离效率不理想所引起的色谱峰加宽效应的改正，不但实验方法比较烦琐，而且数据处理也比较复杂，需要用电子计算机来计算。所以虽然文献中已经推荐许多据说是比较满意的计算方法，但这总不是一个根本解决的方法。只有真正找到绝对分子量检测器，问题才算较好解决。原有的许多分子量测定方法，由于不能做到足够灵敏的瞬时响应而未能成功地在凝胶色谱上应用。 最近Ouano用激光小角光散射仪(LALLS)来作分子量检测器得到比较好的结果。实验数据不需要标定曲线， 也不必进行峰加宽改正。 由于激光的准直性较好，强度较大，可以允许在较小的角度下测量较稀溶液的散射光强，由此

15、可以直接计算出重均分子量的近似值而不需要象经典光散射那样实验数据还要对浓度和散射角度向零作双外推。实验上，凝胶色谱仪和激光小角光散射仪联用后，还可与计算机直接联接进行数据处理。在一次实验进行完毕后，所需要的数据可全部立即取得。GPC-LALLS似乎得到更合理的数值。激光小角散射仪已开始商品化，预计不久将会有更多的研究工作，来说明已经在何种程度上解决了凝胶色谱的相对测定过渡到绝对测定。凝胶色谱中的浓度检测器和通常的液体色谱一样仍然是一个薄弱环节，继续在寻找更理想的检测器。目前最常用的仍然是示差折光检测器和紫外检测器。 最近Hoffmann和Urban用自动浊度滴定装置来作浓度检测器也收到一定效果

16、，特别对二元共聚中测定分子量分布和组成分布，效果比较显著。Jorgenson等用光散射法侧定淋出溶质的沉淀，也证明是一个较灵敏的方法。Francois等用密度计来检侧浓度，提供了另一条通用性检测器的途径。其他如质谱和原子吸收光谱也都能与凝胶色谱联用。随着应用的扩大，凝胶色谱可以用于测定高聚物长支链的支化度。2.4 在色谱理论上的改进2.4.1 塔板理论保留时间是样品从进入色谱柱到流出色谱柱所需要的时间，不同的物质在不同的色谱柱上以不同的流动相洗脱会有不同的保留时间，因此保留时间是色谱分析法比较重要的参数之一。 理论塔板数（theoretical plate number），N色谱的柱效参数之一

17、,用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。当然，N的大小和柱子长度有密切关系：理论塔板高度H=柱长/N，用H可以衡量单位长度的色谱柱的效率，H越小，则色谱柱效率越高。 N为常量时，W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组份含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。 用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更容易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。 N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论

18、塔板数。2.4.2 理论成果 在整个液体色谱领域里，高效液体色谱取代经典的液体色谱的趋势是非常迅速的。这是由于色谱理论、填料制备技术和仪器合理设计三方面联合发展的必然结果。凝胶色谱向高效阶段发展就其本身来说，又是一次意义较大的进展，因为凝胶色谱虽然具有许多优点，但是它一直被认为是一种分离效率比较低、色谱柱的峰容量小和速度慢的技术。在广泛的非高分子化合物领域中没有得到应有的使用。 在经典的凝胶色谱中，。凝胶色谱峰容量较小的原因是和体积排除的分离机理有关。这些缺陷的克服都有待于填料柱效的大幅度提高。高效凝胶色谱填料的合成成功以及高效装柱技术的发展，实现了柱效的提高，从而实现了实验时间缩短，峰宽变窄

19、和峰容量增加。 现在粒度为10 的填料可以使分子量分布测定时间从三小时缩短到十几分钟，这个时间甚至比高分子在溶剂中溶解所需的时间还短。在工业上已有人用凝胶色谱图来作为订购验收指定分子量分布的高聚物产品。由于不需要费太多时间来做条件试验，凝胶色谱在一般化合物领域里应用时的方便程度已可以和其他类型高效液体色谱相竞争。参考文献：1 白颖, 李建伟. 凝胶色谱法测定高聚物的平均分子量及分子量分布J. 塑料科技, 2007,(04) 2 衣学飞, 张涛, 张艳丽, 李义君. 凝胶色谱法测定BOPP分子量及其分布J. 炼油与化工, 2007,(02) 3 陈建华, 王均甫, 宋兰英, 陈同军. 凝胶色谱法测定顺丁橡胶平均分子量及其分布的研究J. 色谱, 1998,(02) 4 陶澍, 武会先, 张宗敏. 水生腐殖酸分子量分布研究.串联凝胶色谱法测定水生腐殖酸分子量分布J. 环境科学学报, 1990,(01) 5 陈贤苓, 雷中方. 凝胶色谱法测定木素的分子量分布J. 实验室研究与探索, 1993,(04) 6 成跃祖. 用TI-59型计算机计算高聚物凝胶色谱的积分分子量分布J. 石油炼制与化工, 1992,(05) 7 刘咏梅.凝胶渗透色谱在农药残留分析中的应用D. 北京化工大学,2004