细胞培养的基本方法.ppt

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1、细胞培养的基本方法,细胞培养的基本概念,2,细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内 环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一 一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞， 也可以是细胞群。,细胞培养的目的与用途,2,一、基础研究 (1) 药物作用机理 (2) 基因功能 (3) 疾病发生机理 二、科学研究: (1) 新药筛选:如药效研究,中药有效成分筛选等. (2) 疫苗研究与开发:如肝炎疫苗, 艾滋病疫苗，肿瘤疫苗等. (3) 基因工程药物与细胞工程药物的研究与开发 (4) 单克隆抗体制备,细胞培养主要的设施器材,2,设施：超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、冰柜、恒温 水

2、浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。 器材： 一、玻璃器材 玻璃培养皿、刻度吸管、离心管、培养瓶等，（现已较少使用）。 二、塑料器材 多孔培养板（6,12,24,48,96）、培养皿、培养瓶、离心管、冻存管。 三、橡皮器材 橡皮制品（最好是硅制品）做各种瓶或试管的塞子、盖子。 四、金属器材 剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头 五、其他物品 纱布、注射器、针头、滤头,细胞培养的条件,（1）适宜的温度和PH 37，pH7.27.4。 （2）气体环境 95%空气+5% CO2; 适宜的湿度（无菌水不能干掉）。 （CO2：细胞生长所必需的成分, pH值维持，最低不能低于1%。）

3、 （3）营养物质 N 源、C源、无机盐、维生素、H2O，细胞培养基中含有。 常用的细胞培养基：DMEM，RPMI-1640，BME，M199 等。 （4）无菌条件 紫外消毒、空气过滤、无菌滤头，高压灭菌、严格操作。,设施、器材、试剂实物图,培养细胞的分类,按照是否贴壁： 贴壁细胞：大多数属此类细胞，如肿瘤细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、神经胶质 细胞等。 悬浮细胞：主要为取自血、骨髓、脾的细胞，如白血病细胞。 按照传代次数： 原代细胞：即从体内取出组织接种培养而未经传代的细胞。（也有人把传代10次之 内的细胞统称为原代细胞。） 细胞系：指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。如HeLa

4、细胞、 CHO细胞等。,原代培养,原理： 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、 螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培 养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。,原代培养方法：消化培养法、组织块培养法。,原代消化培养法,（1）处理组织：用Hanks液漂洗组织23次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先 置于含有青链霉素的混合液中3060分钟。 （2）剪切：将组织切成23毫米大小的块，加入胰蛋白酶液，然后一并倒入培养皿中。 （3）消化：置于37温箱消化，每隔20分钟摇动一次。消化时间依组织块的大小和 组织的硬度而定。 （4）分离：用吸管吸出少许消化液

5、在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞， 立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （5001000转/分）离心收集细胞，弃上清。 （5）加入适量培养基重悬细胞，分装入培养瓶中，补足培养基。 （6）培养：置于37，5%CO2温箱培养。,原代组织块培养法,（1） 剪切：用Hanks液漂洗二三次以去掉组织块表面血污，剪成1mm3小块。 （2） 摆布：将组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml 培养瓶底可摆布2030块。 （3） 轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，盖好瓶塞， 置36.5温箱培养2小时左右（勿超过4小时）

6、，使小块微干涸。 （4） 培养：从微箱中取出培养瓶，46度斜持培养瓶，向瓶底脚部轻轻注入培养液少 许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块。 置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。,细胞的传代,细胞传代的概念： 随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将原有细胞分成几部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养，这个过程就称为传代（passage）。,传代方法： 悬浮细胞传代、贴壁细胞传代。,细胞的传代,悬浮细胞传

7、代：（1）收集细胞悬液； （2）离心（1000转/分，2分钟）； （3）弃上清； （4）加入新鲜培养基重悬细胞； （5）按照适当比例接种到新的培养皿； （6）补足培养基； （7）放于温箱培养。,重悬,分装,放入温箱,细胞的传代,贴壁细胞的传代：（1）吸去陈旧培养基，并用PBS清洗细胞表面； （2） 加入胰酶消化细胞； （3）加入新鲜培养基终止胰酶消化； （4）将细胞吹打下来，收集，离心； （5）弃上清； （6）加入新鲜培养基重悬细胞； （7）按照适当比例接种到新的培养皿； （8）补足培养基； （9）放于温箱培养。,终止胰酶消化并吹打,重悬,分装,放入温箱,细胞的换液,悬浮细胞换液：收集细胞悬液

8、、离心、弃上清、加入新鲜培养基重悬、补足培养基。 或者直接从旧瓶吸取一定细胞悬液加入新瓶，补足新鲜培养基即可。 贴壁细胞换液：弃去陈旧培养基、PBS清洗细胞表面、加入新鲜培养基。,细胞的冻存,悬浮细胞的冻存：（1）配制冻存液（胎牛血清：二甲基亚砜 9:1），每个冻存管需要 冻存液1ml。 （2）收集细胞悬液、离心、弃上清、用冻存液重悬细胞、分装至冻 存管中，并立刻放入冻存盒内，放入 - 80冰箱，第二日转存 于液氮中。,细胞的冻存,贴壁细胞的冻存：（1）配制冻存液。 （2）弃去陈旧培养基，PBS清洗细胞表面，胰酶消化，终止消化， 吹打细胞，收集悬液、离心、弃上清、用冻存液重悬细胞、分 装至冻存

9、管中，并立刻放入冻存盒内，放入 - 80冰箱，第二 日转存于液氮中。,细胞冻存的注意事项：,（1）冻存液要最先配置。 原因一：二甲基亚砜（DMSO）在加入血清时会产热损伤细胞。 原因二：如果先用血清重悬细胞，再加入DMSO，则局部DMSO浓度过高，会 对细胞造成严重损伤（DMSO在室温下对细胞有害），影响日后的复苏。 （2）冻存时要求细胞状态良好，最好是取对数期细胞冻存，以保证复苏后的存活率。 （3）最大限度的减少DMSO在室温下和细胞接触的时间。 （4）冻存时要缓慢降温（慢冻），用细胞冻存盒可以做到每分钟降低1，细胞冻 存盒应先放在4 预冷，以减少细胞和DMSO在室温接触的时间；如果没有冻

10、存盒，则采用程序降温法。（4冰箱40min， -20冰箱30-60min， 置于-80 过夜，次日转入液氮。）,细胞的复苏,悬浮细胞和贴壁细胞的复苏方法一样，区别在于复苏后死细胞的清除方法。 复苏流程：（1）取一支离心管，加入3ml的新鲜培养基备用。 （2）取出冻存的细胞，于37的温水中，1min之内迅速融化。 （3）迅速将解冻后的细胞加入预先准备好的离心管中，1000转/分钟，离 心1分钟。 （4）弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞。 （5）接种到培养皿（瓶）内，补足培养基，放入温箱培养。,细胞的复苏,复苏后死细胞的清除方法： 悬浮细胞：细胞复苏后，每2天按照2:1或3:1的比例传代一次，大约1

11、周后，细胞生长 状态良好。 贴壁细胞：细胞复苏后6h（此时已有细胞贴壁），吸去培养基（含有大量死细胞）， 重新加入新鲜培养基。,细胞复苏的注意事项,（1）细胞复苏原则：快速融化（快融）。 （2）尽量减少室温下DMSO和细胞接触的时间。 预先准备好离心管并加入新鲜培养液； 在1分钟之内将细胞融化； 立 刻将融化后的细胞倒入离心管中。 （3）复苏时，离心时间不宜过长，1分钟即可，长时间离心会对细胞造成损伤， 降低细胞存活率。 （4）死亡的细胞应尽快清除掉，否则会影响存活细胞的状态。 （5）如果复苏不成功，更可能是因为冻存或保存过程中出现问题。,细胞污染时的处理,有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原

12、因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细 胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采取以下办法清除。 （1）使用抗生素 污染后清除用药需采用大于常用量510 倍的冲洗法，于加药后作用2448 小时， 再换常规培养液。此法在污染早期有效。 （2）加温处理 将污染的组织培养物放在41培养18 小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。 所以在处理前要进行预试验，摸索能最大限度杀死支原体又对细胞影响最小的加热时 间。若先用药物处理后，再以41加温处理效果更佳。,其他注意事项,（1）细胞房要定期擦拭：包括地面、桌面、超净台等，先用自来水擦拭 ，再用消毒 液（3 的来苏尔或者新洁尔灭）擦拭，之后打开紫外灯，照射2h。 （2）细胞培养箱定期灭菌：将培养箱中的铁架取出，高压灭菌，箱内壁用75%酒精 擦拭，再用消毒液擦拭，紫外照射过夜。 （3）及时更换CO2罐和HEPA过滤器，确保培养箱中有充足的无菌水。 （4）及时补充液氮，不可使细胞露出液氮表面。 （5）进入细胞房要更换无菌服，带好手套、口罩、鞋套等。,Thank You!,