蛋白质折叠与细胞内的蛋白质折叠.ppt

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1、第三章:蛋白质折叠 第四章: 细胞内的蛋白质折叠,第三章:蛋白质折叠,一、蛋白质复杂的三级结构信息贮存于氨基酸序列中,关于氨基酸序列与蛋白质空间结构的关系研究，最早的工作是由C.Anfinsen (1960)关于核糖核酸酶的研究工作他研究了核糖核酸酶的去折叠和重折叠过程。该酶是由124 个氨基酸组成的蛋白质有四对二硫键，其组合有105(2 4)!/24 4!=105种的可能方式。当用还原剂如b-巯基乙醇(HOCH2-CH2-SH)作用时二硫键被部分还原，继续加大b-巯基乙醇的量，二硫键可全部被还原。用8 M 的脲加b-巯基乙醇处理，多肽链分子内四对二硫键可全部被还原，肽链伸展为无规卷曲，酶活性

2、完全丧失。但如果将脲和b-巯基乙醇透析掉并在空气中进行氧化，多肽链可又重新折叠为一个具有特定的三维结构和催化活性的酶，它与未经处理的酶具有相同的溶解度并可结晶并获得相同的X-射线衍射图，其吸收光谱也相同。 这是一个很好的蛋白质一级结构序列决定其三维结构的例子即顺序决定构象,二、关于蛋白质折叠的理论模型,各种实验及理论计算均证明蛋白质的天然构象在热力学上是最稳定的,1、 框架模型(Framework model): P. S. Kim 和R. L. Baldwin 于1982 年提出了蛋白质折叠的框架模型。该模 型认为，在蛋白质折叠的过程中大约有15 个氨基酸残基的多肽链首先折叠为瞬态的a螺旋或

3、b片层结构的二级结构单元，然后这种瞬态的结构通过扩散彼此接近形成aa ab 或bb的复合结构而获得稳定这种复合结构，又称为折叠单元，折叠单元作为一个核心，吸引和稳定其它摆动着的二级结构单元形成折叠框架其它的侧链将适应这个框架。,2 疏水折叠模型(Hydrophobic Collapse Model)和熔融球态模型(Molten GlobuleModel): 该模型提出折叠是由疏水折叠开始的。即四体石蜡的疏水片段首先聚集 在一起，然后进一步聚集长大，形成一种称为熔融球蛋白中间体，此种结构是一种具有二级结构，但很少有三级相互作用的结构。疏水残基有很大一部分暴露在溶剂中。,三、蛋白质的去折叠(unf

4、olding)和重折叠(refolding),蛋白质的去折叠和重折叠，亦即蛋白质的变性和复性。蛋白质的折叠状态只有在最适条件下才可存在。环境的改变诸如温度、pH 、变性剂、压力等作用都可使蛋白质的结构被破坏,变性的物理基础是：pH 的改变可使盐键断裂，使埋藏在蛋白质结构内部的非解离基团得到裂解，而暴露出来蛋白质去折叠以减少静电相互作用。,变性剂如脲素和盐酸胍等可使蛋白质结构中的氢键发生断裂，这增加了非极性分子包括氨基酸侧链的溶解度，减少了疏水相互作用。脲素还可以深入到蛋白质分子的内部，影响蛋白质分子的密堆积。此外，去污剂、有机溶剂、重金属、热机械力、冷冻超声、高压辐射等均可引起蛋白质的变性这些

5、变性均不会破坏蛋白质的共价键，而是只涉及到氢键、盐键、疏水相互作用、范得华相互作用等次级键的破坏。有些变性的蛋白质，当变性因素被除去后又可自动地恢复到天然状态，这种现象称为蛋白质的复性(renaturation)， 这种复性即蛋白质折叠研究中的重折叠(refolding),加热, 酸或碱盐, 破坏不牢固的次级键，使蛋白质功能丧失,不可逆变性,蛋白质的变性失活,核糖核酸酶,可逆的变性: 恢复到正确的折叠结构恢复生物学的活性,变性因素,物理因素：加热、加压、超声波、 紫外线 化学因素：胍、脲、有机溶剂、 强酸强碱、 SDS -巯基乙醇、 重金属离子 生物碱试剂,蛋白质变性后：,溶解度 生物活性丧失

6、及易被蛋白酶水解 粘度 结晶能力消失,复性,蛋白质的变性程度较轻，去除变性因素后，又恢复了原有的空间构象和生物活性,即可逆变性.,四、蛋白质折叠的热力学,五、蛋白质折叠的识别,将一个新的顺序与一个已知的特征化的, 三维结构花样的叠合识别在大多数情况下是比较成功的，在某些情况下是相当可靠的。尤其是当两个蛋白具有相同的重要氨基酸顺序时，它们总是在那些区域具有相同的三维结构。,六、蛋白质折叠识别的方式,折叠识别的方式之一, 是通过比较从进化分叉机理上紧密相关蛋白的家族,列出一个直接了当的取代/插入/缺失(sub-in-del)的表,然后进行对齐比较, 这种对齐直接表示了在一致性顺序(consensu

7、s sequence) 中每个位置的功能容忍性与由进化所产生的顺序变化之间的关系,这种预测方法的最显著的特点是利用了可由同源蛋白家族序列所推断的大量的结构信息。虽然对于二级结构的预测似乎有较高的准确性，但往往有可能发生的严重错误，即把a螺旋预测为b折叠或反之。利用了同源蛋白家族序列就使得这种发生严重错误的可能性大大降低，此外由于环区域常常具有一个或多个插入/缺失因而可更好地进行预测,另一种折叠的识别方式即所谓的Threading 。此方式主要是通过分析已知蛋白的由实验所测得的三维结构，来估计可允许的sub-in-del 而非进行未知结构与其同源家族的多重对齐。,即用已知蛋白质结构中的氨基酸类型

8、的经验配对势的大小，来衡量取代的可能性。简言之，一个位置上可取代的容忍度，是通过某个位置上和其残基周围的所有位置上的氨基酸类型间的相互作用自由能来估计的,第四章: 细胞内的蛋白质折叠,离体实验并不能精确地反映细胞内新生蛋白质的实际折叠过程.离体情况下蛋白质的去折叠后的再折叠(refolding)过程对蛋白质浓度及物理化学条件的要求完全不同于在细胞内所发生的情况 在离体情况下的再折叠实验往往涉及到整条肽链, 而在活体情况下则是当新生肽段的N 端在核糖体上一经合成或 刚从细胞膜上移位, 折叠活动就开始了。 3） 在细胞中许多蛋白质是以均一或不均一的寡体复合物就开始装配，而在离体的情况下当浓度如细胞

9、内那么低时形成复合物的可能性极小,在细胞内至少存在两类蛋白质涉及到蛋白质的折叠这些蛋白被称作辅助蛋白(accessory protein),第一类蛋白质是一些酶类，这些酶催化特殊的异构化反应步骤，从而限制了某些蛋白质的折叠速度。包括蛋白质二硫键异构酶(ProteinDisulfide Isomerases, PDIase) 、脯氨酰顺-反异构酶(Peptidyl Prolyl cis-trans Isomerases, PPIs, 或称Rotamases) 第二类蛋白质被称为分子伴侣(Molecular Chaperones)， 它们可稳定未折叠的或部分折叠的结构，限制不合适的分子内或分子间相

10、互作用，有些成员可与天然状态的蛋白质分子相互作用引起结构重排,一） 二硫键异构酶(PDIase),PDIase是一种含有486 个氨基酸残基亚基的真核均二聚体酶(homodimeric eukaryotic enzyme) 。它有催化二硫键的链间交换使多肽链间的二硫键达到正确配对的功能。奇妙的是PDIase 还是具有a2 2 异四配体脯氨酰羟化酶(heterotetramer prolyl hydroxylase)的亚基，该羟化酶可使胶原蛋白的脯氨酸残基羟化，其反应的重要性目前尚不清楚,在真核细胞中，二硫键在蛋白质被输运到细胞表面之前在内质网中形成。在细胞内二硫键异构酶protein disu

11、lfide isomerase, PDI 可催化内二硫键的交换以防止形成不正确的二硫桥,一） 二硫键异构酶(PDIase) 结构,PDI is now known to catalyze all of the reactions that are involved in native disulphide bond formation. Native disulphide bond formation is a complex process. Disulphide bonds forming (oxidation) Incorrect bonds must be broken (reduct

12、ion) or rearranged (isomerization).,The enzyme PDI is a multi-domain, multi-functional member of the thioredoxin (a family of small redox active protein) superfamily. PDI can catalyse thiol-disulphide oxidation, reduction and isomerization. Isomerization occurs directly through intramolecular disulp

13、hide rearrangement or through cycles of reduction and oxidation.,Human PDI family,Yeast PDI PDB: 2B5E,Human PDI Domain a, a, b, b PDB: 1ERT,Structure of PDI,Tian G. et al cell 2006,Structure The b and b domains both display minor variations from the typical thioredoxin fold. The interface between th

14、e b and b domain is extensive with a buried surface area of 7002, and the interfaces between the a and b domains and the b and a domains are only 2002. The active sites in the a and a domains point at each other, but are separated by a large U shape cleft, and the distance between C61 and C406 is 28

15、 .,There are several hydrophobic patches of surrounding the active sites in the a and a domains and each of the b and b domains have one hydrophobic patch at the same relative sites. The primary substrate binding site has been mapped to the b domain for mammalian PDI. The hydrophobic patch on the b

16、domain extends the substrate binding site of the b domain to form a larger substrate binding platform, which is located between the two active sites in the a and a domains.,Structure & Function,Despite the high overall structure similarity, a few differences between the active sites are identified,

17、which are likely to reflect the different catalytic properties of the a and a domain. The most noteworthy difference between the a and a domains is the redox state of their active site cysteines. The a domain is more stable in the oxidized form, while the a domain prefers to be in the reduced form.

18、The equilibrium constant (Kox) for the oxidation of the cysteine pair in each active site by oxidized glutathione (GSSG) is 17 mM for the a domain and 1 mM for the a domain. Based on the Nernst equation, the corresponding standard redox potentials are -188 mV for the a domain and -152 mV for the a d

19、omain.,Structure & Function,图4-1 牛胰蛋白酶抑制剂的结构,在胞外的蛋白质折叠研究中二硫键的 形成已被人们进行了较深入的研究,三对二硫键分别被标以绿色，链被标以蓝色，a螺旋被标以红 色。该蛋白在完全还原状态是非折叠的，只有再被完全氧化形成二硫键后才能重折叠,图4-2 BPTI的折叠途径,BPTI 的折叠途径：非折叠的蛋白在还原状态有六个半胱氨酸残基，主要的单二硫键中间体在残基30 和51 之间，有一对二硫键。此中间体进一步形成双二硫键中间体，此中间体含有非天然的二硫键，此中间体对天然二硫键中间体Cys30-Cys51 和Cys5-Cys55 的形成是主要的。一旦形

20、成了这样的双二硫键中间体第三对天然二硫键Cys14-Cys38 将会迅速形成,BPTI 的折叠路径清楚地解释了二硫键重排对于折叠过程的重要性，对于细胞中有酶的存在将增加这些限速反应的的速率，二硫键异构酶大大地提高了细胞外BPTI 折叠的速率,在二硫键的形成和正确配对的过程中存在着一个限速步骤。一种是认为在Cys30-Cys51 二硫键形成后，非天然的Cys5-Cys-14和Cys5-Cys38 稳定了折叠中间体，限速步骤是二硫键发生重排。另一种观点认为天然的Cys30-Cys51 和Cys14-Cys38 是关键的中间体，此时半胱氨酸5 和55 被包埋在分子的内部，为了将包埋在内部的半胱氨酸5

21、 和55 暴露出来以形成Cys5-Cys55， 这对二硫键Cys30-Cys51 需要重折叠然后二硫键发生重排，因此Cys30-Cys51 和Cys14-Cys38 中间体的重折叠是限速步骤,二、脯氨酰顺-反异构酶(PPIs),蛋白质一级结构中C=O 和N-H 基团通常位于肽平面的相反方向上，这种反式肽(trans-peptide)是肽基团的最稳定的方式。然而另一种可能的构型方式顺式肽(cispeptide)也是具有平面性的只是C=O 和N-H 基团位于相同的方向,对大多数肽链来说顺式要比反式的稳定性低至少1000 倍，因此在天然蛋白质中顺式肽是很少的。但是如果当第二个残基的R2 是脯氨酸时顺

22、式形式，仅比反式形式的稳定性低4 倍，因此顺式脯氨酸肽可出现在许多蛋白质结构中。 顺式脯氨酸会出现在多肽链紧密弯曲的位置上，有时对于活性和构象柔性也需要此种构型,图4-5 (a) 肽单位可接受反式(trans-)和顺式(cis-)两种不同的构象； (b) 反式(trans-)和顺式(cis-)脯氨酸。,脯氨酰顺-反异构酶(PPIs)催化顺-和反-构象之间Xaa-Pro 肽键的慢互变，因此可加速含有脯氨酸的多肽链的折叠促进脯氨酸残基顺式多肽键的形成,Cyclophilin可催化顺和反脯氨酸的异构。Cyclophilin 提高了脯氨酸肽的顺反异构化作用的速率，与非酶作用相比大约提高了一百万倍。虽然

23、酶的作用的机理仍不清楚，但可以肯定的是它引起肽基团的变形和解聚 Cyclophilin 与一个含有脯氨酸的四肽的复合物的晶体结构已解析。,图4-6 Cyclophilin与一个含有脯氨酸的四肽复合物的结构,为一个八股的反平行桶（蓝色），两段a螺旋（红色）位于外部，与含有脯氨酸的四肽（绿色）结合的活性部位位于桶的外部,脯氨酸残基紧紧地结合在结合沟的疏水口袋中，并且羧基端氧原子与蛋白质的的碱性侧链形成氢键，肽片段与疏水环境的结合，通过减少肽基团的电荷分离而促进了顺反异构化作用，并产生了具有单键特征的肽键，同时与Cyclophilin 的紧密疏水相互作用，可使肽基团的几何学上变形产生异构化作用这两种

24、机理或它们的组合将减少绕肽键转动的能垒。此能量是顺反异构化所必需的,三、分子伴侣(Chaperone),非折叠蛋白含有大量的暴露于溶剂的疏水区域，并因此有形成分子内和分子间聚集的倾向。分子伴侣就是一类具有阻止不正确的折叠或修正不正确折叠的蛋白质，尤其是对于多结构域蛋白和多亚基蛋白的不正确折叠分子伴侣起着极其重要的作用,在细胞内分子伴侣并不催化二级结构的形成，而是在蛋白质知折叠的过程中，去识别和稳定部分折叠的中间物，使肽链进行装配和去装配。它们是通过与非折叠或聚集多肽的暴露于溶剂的疏水表面结合并逐步释放它们来达到此目的,图4-7 大肠杆菌PapD蛋白的晶体结构,PapD是一个促进毛发蛋白合适组装

25、的分子伴侣，但不是它的组成部分。分子伴侣与毛发蛋白亚基C 端的一个19 肽的保守肽段的复合物的结构,PapD 蛋白由两个结构上相似的结构域组成。球状CPK 模型表示的是毛发蛋白的保守多肽。该多肽与PapD 蛋白的G1b链结合并显示伸展的构象。多肽链与蛋白之间以氢键连接，多肽链末端的羧基锚在PapD 蛋白的两个结构域的接点的分叉上，并通过氢键与蛋白的不变残基Arg8(R8)和Lys112(K112) 残 基结合，PapD 的突变研究表明这些残基的突变将使其丧失与毛发蛋白亚基结合的能力。G1b链的保守疏水残基以绿色表示。从图中我们可看到PapD 蛋白有一个宽的裂缝，此裂缝含有几个保守的暴露于溶剂的

26、疏水残基这些残基在功能上是专一性地与PapD 的靶肽片断结合,Chaperones are a class of proteins which bind to incompletely folded or assembled proteins in order to assist their folding or prevent them from aggregating.,Crystal structure of human Hsp90-alpha.PDB:2h55,Crystal structure of the carboxy-terminal domain of htpG, the E

27、. coli Hsp90 PDB:1sf8,Crystal Structure of the Middle Domain of HtpG, the E. coli Hsp90 PDB:2gq0,Crystal Structure of the N-terminal Domain of HtpG, the Escherichia coli Hsp90, Bound to ADP PDB:2IOR,图4-9 由14个亚基排列为两圈的柱形的分子伴侣GroEL分子的图解,该家族蛋白由14 个分子量为60KD 的亚基组成，这14 个亚基排列成并列的两个分别为7 个亚基的环，每个环都有一个中心的腔该腔可容

28、纳下一个分子量为90KD的球状蛋白，Hsp 60 蛋白与ATP 结合并具有弱的ATP 酶活性，起着稳定折叠中间物的作用。因此可以阻止错误折叠的发生和错误结构的形成，指导多肽链按正确的路线装配,Hsp 60 蛋白,(a) GroEL的亚基结构 (b) GroEL分子中四个亚基结构域排列的图示。近赤道结构域形成分子的中间部分，并且是两个七元环之间的参与反应的结构域。顶点结构域位于圆柱的顶端和底部，并形成一个开放的由顶部，贯串到底部的通道。小的连接结构域在七元环的中部形成圆柱壁的最薄的部分,根据电子显微镜三维重构图形建立的在两者不同的功能态情况下的GroEL分子的模型。GroEL 的大的构象变化发生

29、在GroES 和ATP 结合时，GroES 分子结合在一个GroEL 环上并关闭了中央空腔，这样GroEL 环变大并且空腔内部的腔变得更宽,GroES 结合在GroEL 的顶点结构域上关闭了GroEL 的中央空腔。一旦GroES 结合到GroEL 分子的一个环上，GroES 就发生了构象变化，这降低了对第二个GroEL 环的亲和力，因此GroEL-GroES 复合物的占优势的功能态是不对称的即GroES 仅结合在GroEL 圆柱的一端，显然GroEL分子的两半之间有很强的结构相关性GroES 结合到一半的GroEL上将影响另一半的性质尽管两个GroES 之间有大约150 的距离,GroES 分

30、子由七个亚基组成。每个亚基由97 个氨基酸残基组成，七个亚基饶着一个七重轴，连接 在一起与GroEL 有相同的对称性GroES 的晶体结构表明GroES 的结构象一个园屋顶(dome) ，它的直径大约为75 高度为30 并且在中央部分有一个小孔,GroES的一个亚基的结构,亚基结构的核心是一个由两个折叠片互相堆积在一起的反平行折叠片组成的桶，有两个大的环区域穿过此核心一个环区域伸展在环平面上，园屋顶的顶端覆盖了中央孔，另一个环区域富含疏水氨基酸残基伸展到园屋顶之下与GroEL 的顶点结构域发生相互作用。此环区域在X-射线晶体学结构中是无序，的但核磁共振研究表明当GroES 结合到GroEL 上

31、时此环变得有序。突变研究也表明此环区域上的疏水残基大约分子伴侣的功能是相当重要的,(a) 一个非折叠的蛋白质分子黄色结合到GroEL-ADP 复合物红色的一端，GroES 分子绿色结合到复合物的另一端。 (b 和c) GroES 从反方向被释放然后与ATP 一起重结合在GroEL的正向位置浅红色。(d) 在中央腔中 蛋白正在折叠或去折叠时发生ATP 的水解。(e) GroES 和蛋白质分子的释放需要ATP 的结合和在反方向的水解。(f) 新的未折叠的蛋白质分子重新结合到GroEL 上 有GroES 正向位置结合的GroEL 环受到很大的结构变化，形成宽的由顶点结构域和连接结构域内腔的壁形成的内

32、腔，此腔部分地由GroES 园屋顶的溶剂所封闭。另一个反向位置的环有一个小的对溶剂开放的腔，未折叠的蛋白可以结合在环的正向或反向的位置上但仅仅结合在正向位置上的那些分子能适当的折叠重排，在反向位置的多肽链的结合和释放似乎在功能上并不重要,ATP-bound states of GroEL captured by cryo-electron microscopy,Schematic Diagram of GroEL Functional States (a)Nonnative polypeptide substrate binds to an open GroEL ring. (b)ATP bi

33、nding to GroEL alters its conformation, weakens the binding of substrate, and permits the binding of GroES to the ATP-bound ring. (c)The substrate is released from its binding sites and trapped inside the cavity formed by GroES binding. (d)Following encapsulation, the substrate folds in the cavity a

34、nd ATP is hydrolysed. (e)After hydrolysis in the upper GroES-bound ring, ATP and a second nonnative polypeptide bind to the lower ring, discharging ligands from the upper ring and initiating new GroES binding to the lower ring (f)to form a new folding active complex on the lower ring and complete th

35、e cycle. (f) and (c) are related by 180 rotation. Thus, the rings of GroEL alternate between folding-active and polypeptide-accepting states. (a) and (b) are shown in brackets to indicate that they represent states that are functional in vitro, even though they are unlikely to be significantly popul

36、ated in vivo. The in vivo cycle includes cycling between the asymmetric states (c)(f).,结合在正向位置上的密封腔上的多肽的释放需要GroES 首先被释放，GroES 的释放和它的结合一样需要ATP 的水解，但是ATP 分子是结合在GroEL 的反向的位置上， ATP 在GroEL 反向位置上的水解影响了与之相距100 远的GroES 的结合。一旦GroES 被释放，多肽链就会被释放，这样多肽链可结合到另一GroEL-GroES 复合物上以进行下一个循环，在多重的重复之后天然态的蛋白最后被释放出来。,当然需要回答的关键问题是多肽链在密封的正向腔中发生了什么事件。人们提出了两种模型。两种模型都肯定未折叠或错误折叠的蛋白是由它们暴露的疏水区域并结合在GroEL 腔内部的疏水区域所识别的。一种模型认为腔的功能是将错误折叠的中间体解链，并提供重新折叠的机会以达到正确的折叠，在此模型中折叠发生在跳跃于GroEL-GroES 复合物间多肽的溶剂中。另一种模型认为折叠发生在GroEL-GroES 复合物正向腔中，多肽链或者在此腔中形成天然态或者形成一个最终将形成天然折叠的中间态,