多西环素抑制基质金属蛋白酶对心肌梗死大鼠左室重构和心功能的影响硕士学位论文

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1、安 徽 医 科 大 学 硕 士 学 位 论 文分类号： 密级： ： 编号： 学 位 论 文多西环素抑制基质金属蛋白酶对心肌梗死大鼠左室重构和心功能的影响Doxycycline Attenuate Left Ventricular Remodeling and Improve Left Ventricular Function through Inhibiting Matrix metalloproteinases inPost Myocardial Infarcted Rats2010651指导老师姓名 教授 安徽医科大学附属省立医院 申请学位级别 硕士 专 业 名 称 内科学（心血管病） 提

2、交论文日期 2012-03 论文答辩日期 2012-05 学位授予单位和日期 安徽医科大学 答辩委员会主席 教授 评 阅 人 教授等 2012年3月安徽医科大学ANHUI MEDICAL UNIVERSITY硕 士 学 位 论 文多西环素抑制基质金属蛋白酶对心肌梗死大鼠左室重构和心功能的影响Doxycycline Attenuate Left Ventricular Remodeling and Improve Left Ventricular Function through Inhibiting Matrix metalloproteinases inPost Myocardial Inf

3、arcted Rats作 者 姓 名 2010651指 导 老 师 教授学 科 专 业 内科学（心血管病）研 究 方 向 心室重构机制及干预措施论文工作时间 2012年3月至2012年11月学位论文独创性声明本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明并表示谢意。学位论文作者签名：日 期： 学位论文使用授权声明本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论

4、文的电子版和纸质版，有权允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。愿意将本人的学位论文提交中国博士学位论文全文数据库、中国优秀硕士学位论文全文数据库和中国学位论文全文数据库中全文发表，并可以以电子、网络及其他数字媒体形式公开出版，并同意编入CNKI中国知识资源总库，在中国博硕士学位论文评价数据库中使用和在互联网上传播。保密的学位论文在解密后适用本规定。学位论文作者签名： 导师签名： 日期： 日期：目 录英文缩略词简表5中文摘要7ABSTRACT9前 言11材料与方法21结 果32讨 论36结 论40参考文献40附 录27致 谢

5、28综 述29中英文缩略词简表英文缩写 英文全称 中文全称AMI Acute myocardial infarction 急性心肌梗死ALD Aldosterone 醛固酮ANG II Angiotensin II 血管紧张素IIACEI Angiotensin-converting-enzyme inhibitor 血管紧张素转换（酶）抑制剂ARB Angiotensin receptor blocker 血管紧张素受体拮抗剂CF Cardiac function 心功能CHD Coronary heart disease 冠心病CHF Congestive heart failure 慢性

6、心力衰竭DOC Doxycycline 多西环素ECM Extracellular matrix 细胞外基质HF Heart failure 心力衰竭MI Myocardial infarction 心肌梗死 VR Ventricular remodeling 心室重构 LVR Left ventricular remodeling 左心室重构 MF Myocardial fibrosis 心肌纤维化MMP-2 Matrix metalloproteinase- 2 基质金属蛋白酶2MMP-9 Matrix metalloproteinase- 9 基质金属蛋白酶9LAD Left anter

7、ior descending coronary 冠状动脉左前降支LVAW Left ventricular anterior wall 左心室前壁LVPW Left ventricular posterior wall 左心室后壁LVSD Left ventricular end systolic diameter 左室收缩末期内径LVEDD Left ventricular end-diastolic dimension 左室舒张末内径LVFS Left ventricular fractional shortening 左室短轴缩短率LVEF Left ventricular ejecti

8、on fraction 左心室射血分数RAAS Renin-angiotensin-aldosterone system 肾素血管紧张素 醛固酮系统 中文摘要多西环素抑制基质金属蛋白酶对心肌梗死大鼠左室重构和心功能的影响研究目的 观察多西环素（Doxycycline）对心肌梗死（Myocardial infarction，MI）后大鼠心肌基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）活性的影响及其对大鼠心肌梗死后心衰（Heart failure，HF）和左心室重构(Left ventricular remodeling，LVR)的保护作用。研究方法 将50只SD雄性大鼠用戊

9、巴比妥钠腹腔内注射(70 mg.kg-1)麻醉，电生理仪监测心电图，气管插管并连接呼吸机，设定呼吸频率45次.min-1，潮气量30 ml。其中34只大鼠通过开胸结扎冠状动脉左前降支（Left anterior descending coronary，LAD）建立MI模型，除去死亡2只，共有32只大鼠造模成功，随机的分为模型组(Model group)、多西环素（Doxycycline group, DOC group）组各16只，余16只SD雄性大鼠仅开胸，未予以LAD结扎，称为假手术组(Sham-operated group)。SD雄性大鼠造模成功术后3天开始进行药物干预，其中模型组（腹腔

10、内注射生理盐水0.5ml Bid5天）、多西环素组（腹腔内注射多西环素15 mg.kg-1.d-1 Bid5天），假手术组（腹腔注射生理盐水0.5ml Bid5天）。术后2周后SD雄性大鼠全身麻醉条件下心脏彩超评价SD雄性大鼠心功能，心脏彩超检查结束后处死大鼠开胸右室采血后取出大鼠心脏，用PBS缓冲液冲洗干净，并除去附着的脂肪，称出全心重量（HW）。分别与其体重（BW）比较，计算HW/BW比例。将固定后的心肌组织用石蜡包埋，制成5m厚的切片，用Masson染色法分析心肌梗死面积，各组分别取6只大鼠心肌冷冻组织置于Lysis缓冲液中匀浆，12000rpm离心15分钟，取上清液用明胶酶法分析大鼠心

11、肌组织蛋白MMP-2和MMP-9的活性。研究结果 MI 2周后与模型组相比，心脏彩超提示：多西环素组左室前壁（Left ventricular anterior wall，LVAW）厚度明显增加（P0.05），左室舒张末期内径(Left ventricular end-diastolic dimension，LVDD)缩小（P0.05），左室短轴缩短率(Left ventricular fractional shortening，LVFS)显著增加，左心室射血分数（Left ventricular ejection fraction，LVEF）增高。模型组HW/BW增大明显，与假手术组相比有差

12、异有统计学意义（P0.05），多西环素组虽较假手术组增大，但却较模型组缩小，差异均有统计学意义（P均0.05）。多西环素组梗死面积百分比缩小，明胶酶谱分析证实治疗组心肌组织MMP-2、MMP-9的活性显著低于模型组。结论 多西环素能够通过抑制心肌MMP-2、MMP-9的活性、缩小梗死面积、减轻存活心肌的纤维化而改善心肌梗死大鼠的心功能和左室重构。关键词：心肌梗死 左室重构 基质金属蛋白酶 多西环素 心肌纤维化 AbstractDoxycycline Attenuate Left Ventricular Remodeling and Improve Left Ventricular Functi

13、on through Inhibiting Matrix metalloproteinases inPost Myocardial Infarcted RatsObjectives To observe the effects of doxycycline on the activity of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and MMP-9, left ventricular remodeling and left ventricular function in the post myocardial infarction (MI) rats. Met

14、hods Total 50 male SD rats intraperitoneal injected with sodium pentobarbital (70 mg.kg-1) anesthesia, after anesthesia, all of them with electrophysiology instrument monitoring ECG, endotracheal intubation and connected to a breathing machine (Respiratory rate of 45 times per minute, tidal volume o

15、f 30 ml each time),34 of them made into models of MI by ligation of anterior descending coronary arteryExcept the two died, 32 successful modeling,and then randomly divided into two groups：Model group, Doxycycline (DOC) group, with 16 rats each groupRemaining 16 rats undergoing thoracic surgery with

16、out ligaturing anterior descending coronary artery called sham-operated group. Three days later，rats in DOC group were intraperitoneally injected with doxycycline (15 mg.kg-1.d-1,bid for 5 days), model group were injected with saline solution (0.5ml bid *5 days). Rats in sham-operated group were inj

17、ected with saline solution (0.5ml bid *5 days). Cardiac function were evaluated by echocardiography 2 weeks post MI,After echocardiography examination the rats were all killed,and then open chest removed their heart tissue. Cardiac tissue went through the PBS buffer rinse and removing adhered fat. W

18、e calculated heart weight to body weight ratio, expressed with HW / BW . Cardiac tissue was fixed after the myocardial tissue embedded in paraffin, made of the 5m thick slices,size of MI were analyzed by Masson staining method . Each group were taken six rat myocardium frozen tissue homogenate place

19、d in Lysis buffer, centrifuged at 12000 rpm for 15 minutes and MMP-2, MMP-9 activity were analyzed by gelatin enzymatic analysis. Results, Compared with the model group, the left ventricular (LV) wall thickness increased significantly in DOC group, accompanied with the improvement of LV fractional s

20、hortening and LV ejection fraction (P0.05, respectively), while the LV end-diastolic diameter was significantly reduced (P0.05). Compared with Sham-operated group,the HW/BW in Model group and Doxycycline group were increased , especially Model group were significantly increased ,(P0.05);Compared wit

21、h Sham-operated group,HW/BW in Doxycycline group increased,(P0.05),but reduced compared with the model group,(P0.05).Infarct size reduced significantly in the DOC group (P0.05). The MMP-2, MMP-9 activity in the DOC group was significantly decreased than the model group.Conclusion Doxycycline can imp

22、rove rat heart function and attenuate left ventricular remodeling in post-MI rats through inhibiting MMP-2, MMP-9 activity, reducing the infarct size, alleviating myocardial fibrosis of the heart tissues.Key words: Left ventricular remodeling / Myocardial infarction / Matrix metalloproteinase / Doxy

23、cycline / Myocardial fibrosis 多西环素抑制基质金属蛋白酶对心肌梗死大鼠左室重构和心功能的影响1.引言1.1心肌梗死概念及心梗后心室重构心肌梗死（myocardial infarction，MI）是心肌缺血性坏死，为在冠状动脉病变的基础上，发生冠状动脉血供急剧减少或中断，使相应心肌严重而持久地急性缺血导致心肌坏死。据调查资料显示2008年全球急性心肌梗死（Acute myocardial infarction，AMI）患病率为208/1000000，近些年以来随着医疗水平的进步特别是介入治疗技术的发展，AMI的存活率明显提高，但是MI后左心室重构导致的心功能不全的发

24、生率随之明显升高1。因此干预MI后心室重构（ Ventricular remodeling，VR）成为冠心病治疗的热点及难点问题。心肌梗死导致严重的心肌损伤，心肌损伤后基因组表达改变引起的分子、细胞和间质的改变，分子改变表现为炎症因子、基质金属蛋白酶和生长因子等的表达增加，细胞的改变包括心肌细胞的肥大、坏死、凋亡和成纤维细胞的增殖等，间质的改变表现为细胞外基质的降解及胶原聚集又称纤维化。它们之间关系复杂，共同促进MI后左室重构的发生发展。1.2神经体液系统的激活与VR目前临床应用较多的治疗心衰的药物为受体阻滞剂，ACEI类药物，ARB类药物及螺内酯等，它们很大程度上缓解了心衰病人的症状，延缓了

25、心室重构这一过程的进展，改善患者的预后，以下主要介绍它们的作用机制、不足之处及相关受体的研究进展。1.2.1 肾上腺素受体与VR一项在中国包括1250家医院在内的45852例AMI病人的大型临床实验证实，及早应用-1受体阻滞剂美托洛尔可以降低心肌再梗死的风险、控制心室纤维化进展，对于抑制VR，改善心功能是有意义的，但是同时增加了心源性休克发生的风险，特别是在AMI后一天内血流动力学不稳定时。建议只有在血流动力学稳定后才可以应用-1受体阻滞剂2。有相关研究证实，与-1肾上腺素受体作用相反，-2肾上腺素受体可能具有抗心肌细胞凋亡等心脏保护作用，一项关于MI后大鼠的实验显示：当ACE-1和美托洛尔常

26、规应用的基础上加用-2肾上腺素受体激动剂非诺特罗三者联合与ACE-1和美托洛尔两者联合组相比较，1年后虽然两组的死亡率相同，但是加用非诺特罗组心梗的面积缩小，心室收缩末内径和舒张末内径均较两者联合组明显减小3，这个实验-2肾上腺素受体激动剂作用在于与-1肾上腺素受体抑制剂合用时作用仅维持一年，可能是由于快速的耐药反应导致4，故相关研究仍需继续。1.2.2RAS系统与VR1.2.3 肾素血管紧张素及其受体与VRAng II受体亚型：Ang II 1型受体(angiotensinreceptor II 1)、Ang II 2型受体(angiotensinreceptor II 2)及非典型受体。A

27、T1又分为AT1a和AT1b两种亚型。AT1受体存在于心肌细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、血小板、神经末梢和传导系统，介导所有已知的AngII的心血管作用，特别是通过活化细胞周期蛋白、降低细胞周期激酶抑制因子而加强血管壁DNA的合成 。Maczewski 等人关于48例AMI后未行再灌注治疗的患者的研究显示，血小板上AT1R（AT1）受体密度越高，患者发生VR继而心力衰竭的几率就越大5。Ang是RAS中最主要的活性物质，与受体结合后可激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，活化的PKC可以通过各种信号转导途径促进心肌成纤维细胞(myocardial fibroblasts，

28、MFs)增殖，诱导心肌纤维化，导致VR6。目前关于AT2的作用尚存在争议，Ichihara等人研究证实AT2在VR中起了重要的作用7。Tsutsumi等人通过实验证实选择性刺激大动脉平滑肌细胞AT2能够增加缓激肽释放，进一步使得NO合成增加，引起舒张血管的效应，显示长期抑制AT1表达、同时增加AT2表达，对于控制高血压病人的血压水平是有意义的8。另有实验证实血管紧张素受体(AT1受体)拮抗剂，可以阻滞AngII促心血管细胞增殖肥大作用，同时ATI受体被阻断后，反馈性地使血浆肾素增加23倍，导致血浆中的Ang浓度升高。由于ATl受体已经被阻滞，这些反馈作用难以表现。但血浆中升高的AngII通过激

29、活AT2受体，进而激活缓激肽-一氧化氮途径，产生舒张血管、降低血压、抑制心血管重构等作用；Kaschina 等人研究结果显示直接激活AT2受体可以通过抗凋亡及抗炎机制抑制VR9。目前临床应用较多的是ACEI、ARB，一项大规模的临床实验显示：缬沙坦和卡托普利在改善心功能，抑制梗死后VR作用类似，但是ACEI和ARB联合组并不能减低死亡率，反而临床上不良事件增加，故临床上建议单一用药10。1.2.4醛固酮（ALD）与VR醛固酮（ALD）与VR：醛固酮的生理作用：1引起水钠潴留、低钾低镁血症发生。2抑制迷走神经调节通道，增强交感神经活性抑制迷走神经调节通道，使压力反射性心动过缓反应减弱。3ALD受

30、体复合物进入细胞核与DNA结合，影响I、型胶原基因表达，使得胶原合成增多同时胶原降解速度减慢，对于心肌肌小节数量、排列及心肌细胞直径大小、细胞间质等产生影响,促进VR11。CHF治疗中的“ALD逃逸现象”：在心衰时，由于血管紧张素水平增高，刺激ALD合成分泌增多。短期使用ACEI治疗CHF时ALD下降，但长期应用ACEI时，常出现“ALD逃逸现象”，即ALD水平不能保持稳定持续的降低12,13。研究发现，尽管联合应用了ACEI和血管紧张素受体拮抗剂(ARB)不能完全长期抑制ALD的产生。低钠和高钾是刺激ALD分泌的主要原因；由于ALD在CHF的病理生理中的作用及“ALD逃逸现象”，决定了CHF

31、现代治疗方案中ALD受体拮抗剂具有不可替代的作用。1.3交感迷走神经失衡与VR心脏自主神经之间的不平衡，在心力衰竭的发展中有着重要作用。交感神经的过度活化促进心肌细胞凋亡，加速VR，促进心力衰竭的发生 。目前，抑制交感神经活性的药物，如受体阻滞剂，明显抑制了心肌重构的发生，延缓了心力衰竭的进程，提高了心力衰竭患者的存活时间，因此干预自主神经是治疗心力衰竭有效的手段。有关动物研究显示：刺激迷走神经有利于抑制VR，改善心功能，提高生存率14。一项多中心开放性研究纳入32例心功能II-IV级心力衰竭病人，植入迷走神经刺激装置，规律刺激患者迷走神经达患者最大耐受程度，随访一年，发现患者6min步行由刺

32、激前的（41176）米上升到（471111）米。射血分数（LVFE）由刺激前的（227）%提高到（298）%，该实验证实植入迷走神经刺激装置的安全性，初步结果证实迷走神经刺激对心力衰竭的治疗作用15。然而，目前关于直接迷走神经治疗心力衰竭的临床试验比较有限，其有效性、可行性及安全性仍需要进一步探讨。1.41 心肌细胞凋亡与VR心肌细胞凋亡是一个无炎症反应的过程，在心脏的生理和病理发展过程中均起着重要作用，是心脏由代偿性变化向病理性变化发展的细胞学基础。典型特征为细胞缩小，染色质凝集，核膜折叠，核仁裂解，继而细胞膜出泡（胞？），分割细胞为多个凋亡小体，凋亡小体进而被具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞吞

33、噬、降解。心肌缺血、缺氧、缺血再灌注、低氧、压力及容量负荷过重、自由基产生过多、细胞内游离钙浓度过高以及高浓度血管紧张素等因素均可通过多种途径诱导心肌细胞发生凋亡，如Bax炎症因子途径、线粒体途径和肌浆网途径等16,17。在急性MI后的心室重塑过程中，心肌细胞凋亡也是导致心肌细胞数量减少的重要原因，梗死区、非梗死区及梗死后终末期心力衰竭患者的心肌组织中均有心肌细胞凋亡现象的存在。在结扎大鼠冠状动脉后2 h，梗死区即出现细胞凋亡并迅速达到高峰；结扎后6 h，细胞凋亡为细胞死亡的主要形式18。在正常发育过程中，心肌细胞凋亡的数目具有增龄性变化特征19，是维持心脏组织形态和功能相对稳定的细胞学基础，

34、并且在心脏形态转型和重塑中发挥平衡作用 ，表明无论在正常生理或病理条件下，心肌细胞均存在着凋亡现象，具有增龄性变化特征，凋亡可导致心肌细胞大量减少，并对心功能产生严重影响。1.4.2 心肌细胞再生与VR目前已有大量临床及动物实验证实干细胞移植促心肌细胞再生、改善VR的有效性及安全性。David等人的TOPCARE-AMI试验，通过冠状动脉内输注祖细胞促心肌细胞再生，随访5年发现患者NT-proBNP的水平仍然显着减少，虽然LV收缩末期容积保持稳定，LV舒张末期容积显着增加，射血分数明显提高，心功能显著改善，并且并未发现肿瘤及心内钙化等20。但统观点认为，成体心肌细胞不再进行分裂增殖，细胞数目也

35、不再增加，需进行干细胞移植来促进心肌细胞再生，近期Bergmann等人提供了心肌细胞再生的证据。他们利用大气中的放射性污染发现，在人的生长过程中，心肌细胞确实能够在一定程度上进行更新。冷战时期核弹实验引起大气中的14C（14C）水平增加，这时期地球上所有生物的细胞中的14C（14C）水平都增加。当核实验被禁止之后，人类DNA中14C（14C）水平开始慢慢地下降。细胞在进行最后一次分裂之后，其DNA成分不再变化。因此，基因组DNA中14C（14C）的水平可以作为细胞出生的日期标记。他们监测在核弹爆炸前出生的5名受试者心肌细胞DNA中14C（14C）的含量，结果显示14C（14C）要高于爆炸前大气

36、中的含量，这表明在核弹爆炸后仍有DNA的合成；监测核弹爆炸后出生的7名受试者心肌细胞DNA中14C（14C）的含量与他们出生几年后的大气中含量一致，提示出生后存在DNA的合成。利用数学模型根据受试者心肌细胞中14C（14C）的水平分析其更新率，发现每年可更新02到2 ，并且与年龄呈负相关(R=一（-）084，P=0001)，25岁时每年可更新约1 ，而75岁时每年仅更新045 。人一生中约为50 的心肌细胞是新产生的，但是这些新产生的心肌细胞并不能确认是来自心肌细胞的复制还是干祖细胞库的分化。研究结果提示我们利用药物刺激内源性心肌更新以治疗心脏病可能具有很好的临床前景21。较心肌细胞移植，促心

37、肌细胞再生的优点在于无创性以及可以避免免疫抑制的应用。但目前我们关于心肌细胞再生的机制及影响因素的了解有限，相关研究仍需继续。1.5 细胞外基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase ,MMP）及其抑制剂（matrix metalloproteinase inhibitor,TIMP）与VRMI后除心肌细胞本身的结构、代谢及功能异常外，心肌细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)尤其是心肌胶原亦发生异常改变，ECM成分的过分降解可能导致病理性VR。ECM提供了细胞迁移、生长和分化的环境，主要功能有： 为心肌细胞、血管和淋巴管的相互联系和排列提供支持，

38、从而决定心肌的僵硬度和结构，防止心肌细胞过度伸长及过度回缩，防止心肌细胞和肌纤维滑脱。将心肌细胞产生的压力传至心室腔，提供心肌舒张时的阻力，给心肌提供张力强度以防止其断裂；近年来MI后细胞外基质金属蛋白酶（MMP）及其抑制剂（TIMP）之间的平衡与VR之间的关系是研究比较多，比较有争议的话题。1.5.1 MMP与VRMMPs是一类包含锌离子的内源性蛋白水解酶，有着相似的亚基结构。目前已发现的MMPs家族成员有20多种，根据其底物的特异性和结构的差异分为四大类。第一类为胶原酶(MMP一（-）1，8，l3等)，其主要水解底物是纤维类胶原，即1、2、3型胶原；第二类为明胶酶(MMP-2，9)，主要水

39、解变性胶原及基膜的主要成分4型胶原；第三类为基质水解酶类(MMP-3，10，11等)，其中MMP-3和MMP一（-）10的水解底物比较广泛，如型胶原、蛋白聚糖、明胶及糖蛋白等；第四类为结构与功能比较特殊的MMPs(MMP一（-）7，12，19，20，23，26等)，其除能降解几种ECM成分外，还能激活其他MMPs。Bergmann等人发现心脏基质金属蛋白酶2（MMP-2）的表达异常与VR和心脏收缩功能障碍密切相关22，许多动物实验证实，MMP降解细胞外的基质在AMI后心脏破裂过程中起着重要的作用，Susanne等人监测因AMI心脏破裂死亡患者梗死区MMP-8和MMP-9的含量明显身高，进而引起

40、的炎性细胞的浸润更加突出，最终促进梗死后心脏破裂23，进一步阐述了MMP与VR及MI后心室功能密切相关。1.5.2 TIMP与VR基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)TIMPs是近年来发现的MMPs的天然抑制物，是一组能抑制MMPs活性的多功能因子家族，是体内细胞分泌的一类蛋白酶抑制剂，在肿瘤组织与间质细胞中均可表达 。TIMPs家族是一个多基因家族的编码蛋白，目前已证实的TIMPs有4种(TIMP-1，TIMP-2，TIMP-3和TIMP-4)，它们的表达在发育和组织重构中受调控，它通过对MMPs的抑制在正常细胞外基质改建和各种病理过程中发挥重要作用24。在病理条件下，TIMPs水平的变化

41、与MMPs变化不平衡可直接影响MMPs活性。TIMPs主要从两个方面抑制MMPs的激活： 在酶原活化阶段：TIMP与pro MMP可形成稳定的复合体，并阻碍pro MMP的酶原自我激活； 在活化的MMP阶段：TIMP可直接与活化的MMP形成紧密的1：1复合体，抑制其活性。目前关于MI后46小时及24周血浆TIMP浓度的研究提示：心功能不全患者24周后血浆TIMP-1水平较46小时明显降低，而TIMP-2及TIMP-4水平明显增高，尤其是TIMP-4。TIMP-2及TIMP-4均与左室收缩末及舒张末容正相关。该实现提出早期检测血浆TIMP-4对于预测心功能的重要性，其浓度变化与VR密切相关25。

42、1.5.3TIMP/MMP失衡与VRMMPs选择性地消化分解细胞外基质中的各成分，与TIMPs抑制作用二者相互作用形成相对平衡的状态，控制调节细胞外基质组织胶原的生成代谢和更新。Wei Y等人的研究显示，终末期心衰病人往往伴随有MMP-10和MMP-7的水平大量增加，同时伴随着TIMP-4的降低，该研究提示MMP/TIMP比例的失衡在VR过程中起着重要的作用，并且MMP-10可能成为在VR研究领域除MMP-2、MMP-9以外的一个新的热点研究因子26。Polyakova等人关于不同类型终末期心衰的研究显示：正常情况下TIMP/MMP大概为1.3，而缺血型心肌病其比值增加到1.9，但在扩张型心肌

43、病及其它类型心肌病其比值往往低于1.0。同时他们监测到胶原I/胶原III比值的增加与心室舒张末期压力成负相关。不同类型的心肌病终末期心衰的病人MMP与TIMP之间关系的失衡影响到心肌纤维代谢及各种细胞因子的表达，最终导致心肌纤维化和VR,进一步发展为严重的心功能不全27。1.6多西环素与VR多西环素系土霉素结构改造所得的一种长效四环素类抗生素，用于大多数革兰阳性和阴性菌。近年来发现，该药还是一类广谱的MMP活性抑制剂，目前已在临床上用于牙周病、骨关节炎、腹主动脉瘤和肿瘤转移等间质疾病的治疗28,29,30。多西环素抑制MMP的机制尚不完全清楚，可能的机制有：(1)多西环素能直接与MMP的zn2

44、+和Ca2+结合，从而抑制酶的活性区，并可诱导酶原的构型改变，使之易于分解 ；(2)多西环素能抑制MMP的mRNA转录，并能使酶原在细胞外激活过程中降解31,32；(3)多西环素还有可能通过抑制TIMP的表达，降低MMP的释放和激活33；(4)多西环素可以通过对TGF-和IL的作用(通常TGF-可抑制MMP表达；而IL则相反)，间接抑制MMP的表达34,35。多西环素能通过抑制MMP的释放和激活，有效减轻左室重构，缓解左室收缩和舒张功能，延缓心力衰竭的进展；还可稳定动脉粥样斑块，预防和减少急性冠脉综合征的发生，降低心脏急性事件的发生率。在经过大规模临床随机对照试验获得大量循证医学证据后，有望用

45、于临床心血管疾病的防治。本实验通过建立大鼠心肌梗死模型。观察多西环素作为外源性MMPs抑制剂对心肌梗死后心功能的保护作用。 2.材料与方法2.1实验材料2.1.1实验动物雄性SD（Sprague-dawley）大鼠48只，体重250270 g，均由安徽医科大学实验动物中心提供。2.1.2主要仪器实验用小型呼吸机(HXQ-1型)多道电生理仪(成都仪器厂，RM6240型)IE33超声心动图机(荷兰，飞利浦公司)电热恒温水浴锅上海天平仪器厂隔水式电热培养箱江苏东台县电器厂5415R小型高速冷冻离心机德国Eppendorf公司Minispin小型离心机德国Eppendorf公司超速离心机德国Beakm

46、an公司托盘天平上海第二天平仪器厂电子分析天平 上海奥豪斯公司TS-A型脱色摇床江苏国胜实验仪器厂ZD-9556水平脱色摇床江苏省太仓科教器材厂冰冻切片机德国Leica公司超低温冰箱日本Sanyo公司共聚焦显微镜 Zeiss 公司倒置显微镜 Olympus公司水平电泳仪 北京东方特力电泳电源 BIO-RAD公司电泳仪及附件 BIO-RAD公司电转仪及附件 BIO-RAD公司微量移液器 Eppendorff公司UMAX Powerlook 2100XL扫描仪台湾力捷技术公司手术器械 上海精密仪器厂防脱载玻片 神鹰牌盖玻片 神鹰牌2.1.3主要试剂戊巴比妥 贝尔兰科总蛋白提取试剂盒 贝博生物科技产

47、品组成310003310004规格50assays100assaysBuffer I25ml50ml蛋白酶抑制混合物100ul200ulMasson染色试剂盒（ZC00126，北京雷根生物技术有限公司）提供试剂(A)A-1：苏木素染色液25ml 50ml 250mlA-2：三氯化铁水溶液25ml 50ml 250ml试剂(B) : 盐酸乙醇分化液50ml 100ml 500ml试剂(C) : 氨水 50ml 100ml 500ml试剂(D) : 丽春红酸性品红染色液 50ml 100ml 500ml试剂(E)：乙酸水溶液 50ml 100ml 500ml试剂(F)：磷钼酸水溶液 50ml 10

48、0ml 500ml试剂(G)：苯胺蓝染色液 50ml 100ml 500mlGENMED 基质金属蛋白酶（MMP）明胶酶谱法电泳分析试剂盒由上海杰美基因医药科技有限公司提供GMS30071.1A GENMED 胶体液（Reagent A） 500毫升GMS30071.1B GENMED 凝结液（Reagent B） 10毫升GMS30071.1C GENMED 促进液（Reagent C） 10毫升GMS30071.1D GENMED 胶顶液（Reagent D） 500毫升GMS30071.1E GENMED 电泳液（Reagent E） 500毫升GMS30071.1F GENMED 上样

49、液（Reagent F） 10毫升GMS30071.1G GENMED 复性液（Reagent G） 500毫升GMS30071.1H GENMED 消化液（Reagent H） 500毫升GMS30071.1I GENMED 染色液（Reagent I） 500毫升GMS30071.1J GENMED 祛色液（Reagent J） 500毫升GMS30071.1K GENMED 终止液（Reagent K） 500毫升GENMED 胶原酶潜酶活化剂 APMA 200微升多西环素针剂(国药准字H20060405，海口康力元制药有限公司)UPK-I-10纯水机成都超纯科技有限公司2.2试验方法2

50、.2.1 SD雄性大鼠心肌梗死模型的制作将50只体重250g-270g大鼠用戊巴比妥钠腹腔内注射(70 mg.kg-1)麻醉，从注射到大鼠达到麻醉要求状态一般需要3-5min。待大鼠四肢肌力松弛，彻底处于麻醉状态时固定于鼠板上，予以电生理仪监测心电图，气管插管并连接呼吸机，设定呼吸频率45次.min-1，潮气量30 ml。其中34 SD雄性大鼠只开胸，以前降支为标志，于左心耳根部下方1 mm处结扎冠状动脉左前降支。术后观察心电图出现心肌梗死特征性ST-T改变并持续半小时以上者判定为MI模型成功。除去2只死亡共有32只造模成功，将造模成功的MI大鼠随机分为模型组(16只)和多西环素治疗组(16只

51、)，治疗组在MI模型建立后3天按多西环素15 mg.kg-1.d-1用1ml生理盐水稀释后分两次腹腔注射，模型组仅给予生理盐水0.5ml Bid腹腔注射。另外16只大鼠仅开胸暴露心脏，不结扎冠状动脉，同样予以腹腔注射生理盐水0.5ml Bid5天，作为假手术组，对照造模是否成功以下所示为动物模型制作过程中心电图Fig1冠状动脉结扎前心电图Fig2冠状动脉结扎后10min心电图Fig3冠状动脉结扎后30min心电图以上三幅图比较可以看出，冠状动脉结扎后两张图较结扎前图相比ST段明显抬高，并且持续抬高时间大于30min方为动物模型制作成功。2.2.2 SD雄性大鼠心脏彩超检查两周后将三组MI大鼠用

52、戊巴比妥钠腹腔内注射(70 mg.kg-1)麻醉、称重后，电生理仪监测心电图情况，气管插管呼吸机支持的情况下，用HP-5500型心脏彩超机进行心脏超声检查。图像采集在左室短轴乳头肌平面行M-型超声检查，测量左室前壁厚度(LVAW)、左室后壁厚度(LVPW)和左室舒张末期内径(LVDd)，用Teichholtz法测量左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率（LVFS）。所有资料均录像后脱机分析，计数资料分别测量3个心动周期取平均值。2.2.3 SD雄性大鼠心脏重量与体重比（HW/BW）待大鼠心脏彩超检查结束后脊椎脱臼法处死大鼠，立即开胸右室采血后取出大鼠心脏，用PBS缓冲液冲洗干净，并除去附着的

53、脂肪，称出全心重量（HW）。分别与其体重（BW）比较，计算HW/BW比例。再沿心脏中段横切面切取2mm厚组织，用10%福尔马林固定，心尖部用液氮快速冷冻备用。2.2.4 SD雄性大鼠masson染色将固定后的心肌组织用石蜡包埋，制成5m厚的切片，1、切片脱蜡至水。2、试剂(A)染色 5min10min。（临用时取 A-1、A-2 等量混合，成为试剂(A)，不可预配制后放置， 因铁与染色剂的色素根会化合而形成不容性沉淀，混合后，一般 24h 后失去染色力）3、试剂(B)分化、水洗，试剂(C)返蓝、水洗。4、蒸馏水或者去离子水洗 1min。5、试剂(D)染色 510min。6、试剂(E)洗 1mi

54、n。7、试剂(F)洗 12min。8、试剂(E)洗 1min。9、直接放入试剂(G)染色 12min。10、试剂(E)洗 1min。11、95%乙醇和无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。12、10显微镜下拍照，保存为TIF图片格式后用Image软件进行测量，分析梗死面积占左室面积的百分比。2.2.5 SD雄性大鼠心肌基质金属蛋白酶-2,9（MMP-2,9）活性检测2.2.5.1 提取SD雄性大鼠心肌蛋白各组分别取6只大鼠心肌冷冻组织置于裂解缓冲液中匀浆，12000rpm离心15分钟，取上清液用于分析，具体操作如下。1、 裂解液制备：每500ul冷的Buffer中加入2ul蛋白酶制剂混合物，

55、混匀后置冰上备用。2、 取100mg心肌组织样本剪碎，加入裂解液，用组织匀浆至无明显肉眼可见固体。3、 将制作匀浆吸入另一预冷的干净离心管中，在4下，12000rpm离心15min。4、 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。上述蛋白提取物分装后置于-80冰箱保存备用2.2.5.2 待测活性样本的准备BCA法测定上清液中蛋白浓度。各组织取含蛋白量60ug样本，用MMP-2、MMP-9活性检测试剂盒（GMS30071.1v.A，美国）按说明书操作，检测MMP-2、MMP-9的活性。无离子水：用于稀释浓缩型试剂溶液1.5 毫升离心管：用于样品处理的容器15 毫升锥形离心管：用于胶体溶液配

56、制的容器50 毫升锥形离心管：用于胶体溶液配制的容器培养箱：用于孵育反应物电泳仪：用于蛋白样品电泳分离平式摇荡仪：用于孵育和混匀反应1 移出 毫升 GENMED 胶体液（Reagent A）到50 毫升锥形离心管里2 加入 微升 GENMED 凝结液（Reagent B）3 加入 微升 GENMED 促进液（Reagent C）4 混匀后，即刻移入玻璃槽，避免气泡5 在室温下孵育 45 分钟，或直至胶体凝结6 移出 毫升 GENMED 胶顶液（Reagent D）到15 毫升锥形离心管里7 加入 微升 GENMED 凝结液（Reagent B）8 加入 微升 GENMED 促进液（Reagen

57、t C）9 混匀后，即刻移入玻璃槽，避免气泡10插入0.75 毫米厚的10 孔梳11在室温下孵育45 分钟，或直至胶体凝结12将玻璃槽移入到电泳槽里13加入适量的含有GENMED 电泳液（Reagent E）的GENMED 电泳工作液14小心拔去10 孔梳15用吸管或1 毫升枪头冲洗样品孔备用16从70冰箱里取出待测样品（注意：样品须澄清；参见注意事项3）17移取10 微升样品（20 微克总量）到1.5 毫升离心管18加入 微升GENMED 上样液（Reagent F），混匀19室温下静置10 分钟20小心移取20 微升样品到玻璃槽的样品孔里（包括用户自备的蛋白标准样）21电泳运行1 至2 小

58、时，电压为125 伏，直至染料前沿到达胶底处22关闭电源，取出玻璃板，小心拆开，避免损坏胶体23放进塑料盒24加入90 毫升用户自备的无离子水到塑料盒里25加入 毫升GENMED 复性液（Reagent G）26室温下，平放在平式摇荡仪上孵育1 小时，速度为50RPM27小心倒掉复性液28加入90 毫升用户自备的无离子水到塑料盒里29加入 毫升GENMED 消化液（Reagent H）30放进37培养箱里，在平式摇荡仪上孵育20 小时，速度为50RPM（注意：如果酶活性过低，可以延长孵育时间至40 小时）31小心倒掉消化液32加入50 毫升用户自备的无离子水到塑料盒里33加入 毫升GENMED 染色液（Reagent I），混匀34室温下，平放在平式摇荡仪上孵育60 分钟，速度为50RPM35小心倒掉染色液36加入50 毫升用户自备的无离子水到塑料盒里37加入 毫升GENMED 祛色液（Reagent J），混匀38室温下，平放在平式摇荡仪上孵育2 分钟至30 分钟，速度为50RPM，直至可见深蓝色背景下白色清晰的条带（注意：避免过度去色）39小心倒掉祛色液40加入 毫升GENMED 终止液（Reagent K）41进行拍照记录或成像仪处理和半定量分析：2.3 统计分析 所有数据以均数标准差( s)表示，应用SPSS l6.0统计软件对实验数据进行分析。两组间比较采用非配对