食管癌相关基因4

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1、食管癌相关基因4 ( ECRG4)在肝细胞肝癌组织中表达及临床意义摘要目的 分析ECRG4基因在肝细胞肝癌组织(HCC)中的表达与甲基化情况，并 探讨其临床意义。方法 分别采用免疫组化法、MSP-PCR两种方法检测50例肝 癌组织、对应癌旁组织及 31 例正常肝组织中的 ECRG4 蛋白的表达和 ECRG4 启动 子区甲基化情况，并探讨两者之间的相关性。结果 ECRG4 蛋白在肝癌组织、癌 旁肝组织的表达水平显著低于正常肝组织(P0.05),在肝癌组织的表达水平显著 低于癌旁肝组织(P0.05)；且ECRG4肝癌组织的甲基化检出率明显高于癌旁肝组 织及正常肝组织(PvO.05)。ECRG4蛋白

2、低表达百分率与ECRG4的甲基化检出率明 显相关(均PV0.05)。结论ECRG4在HCC组织中表达下调与其启动子区高甲基化 存在明显的关联性，在肝癌的发生中发挥重要作用。关键词 肝肿瘤; 基因, ECRG4; 肿瘤转移The expression of esophageal cancer related gene 4 (ECRG4) in hepatocellularcarcinoma tissues and its clinical significanceObjectiveToanalysis the expression ofesophageal cancer-related gene

3、 4 (ECRG4)in hepatocellular carcinoma(HCC) and the methylation condition of ECRG4 of promoter region in gastric cancer tissue, and discuss their clinical significance.MethodsWith Immunohistochemistry and MSP - polymerase chain reaction (PCR), detected the protein expression level of ECRG4 and its me

4、thylationcondition in 50 cases of HCCtissues , the adjacent non-tumor tissues and in 31 cases of normal liver tissue respectively. Explore the correlation betweenthe protein expression of ECRG4 and the methylation condition .ResultsThe protein expression level of ECRG4 in HCC tissues and adjacentnon

5、-tumortissues both were significantly lower than normal liver tissues (P 0.05) . The protein expression level of ECRG4 in HCC tissues was significantly lower than adjacent non-tumortissues (P 0.05).The methylation ratesof ECRG4 of promoter region in gastric cancer tissue were significantly higher th

6、an adjacentnon-tumortissues and normal gastric tissues (P 0.05).The lowexpression level and methylation ratesof ECRG4 had significantly positive correlation (P 0.05).ConclusionThe down-regulation of ECRG4 expression was associated with high methylation of ECRG4 promoter region in gastric cancer tiss

7、ue， which is great importance for the occurrence and development of HCC.Key wordshepatocellular carcinoma;Genes ECRG4;Tumor metastasis肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)威胁全世界人民的的常见恶性肿瘤之一。HCC的发生、发展除了与环境等因素有关外，与不同类型的基因结构及蛋白 表达的改变也存在关系 1。食管癌相关基因 4(esophageal cancer related gene 4,ECRG4)是存在正常组织中，但在恶性肿瘤组

8、织中功能失活的一类基因。既往 有学者采用 RDD-PCR 法从正常食管组织和高癌家族中分离出 ECRG4 差异表达序 列2，指出 ECRG4 基因具有抑癌基因的典型结构特征，在核心启动子周围有许多 CpG 岛，且认为 ECRG4 启动子区甲基化可能是致使基因失活的机制之一3。目前 许多研究设想如果能将这种基因的野生型导入基因异常的肿瘤细胞内，便能潜在 地抑制肿瘤的生长可部分或全部逆转其恶性表型，进一步探索肿瘤发生、发展的 分子生物学机制与临床诊断、治疗等实际价值。目前国内关于 ECRG4 基因在 HCC 方面的研究尚未见报道，因此本研究采用应用免疫组织化学技术检测 ECRG4 蛋 白的表达情况

9、；并采用甲基化特异性 PCR(Methylation specific-PCR， MSP-PCR) 检测 HCC 组织中 ECRG4 基因启动子区的甲基化情况，探讨 ECRG4 在 HCC 中的 作用。1 材料与方法1.1 研究对象本研究中 50 例 HCC 患者均为我院 2012 年2015 年收集，手术前均未做放疗 和化疗，以术后组织病理学结果确诊肿瘤类型。年龄在 2970 岁,男 36 例,女 14 例，高分化癌18例，低分化癌32例；FIGO分期标准：I期8例，11期4例， III期30例，切期8例；使用组织标本为手术切除的HCC癌组织和癌旁2cm以 外的正常食管粘膜上皮，石蜡包埋、切

10、片，常规脱蜡水化。1. 2 主要试剂及仪器石蜡组织DNA提取试剂盒(GTpureTM)来自上海基因科技公司；抗ECRG4 的多克隆抗体及 PV9000 试剂购自美国 Zymed 公司，一抗浓度为 1：100。蛋白 酶 K 和 DNA marker DL2000 购自大连 Takara 公司； Wizard DNA cleanup 树脂纯 化试剂盒购自 Promega 公司；其他常规化学试剂均为进口或国产分析纯。1. 3 免疫组化检测将常规脱蜡水化的标本切片PBS漂洗3次（3 min/次），3%也02室温孵 育1020分钟后再PBS溶液漂洗3次（3 min/次）。然后浸于预热的含0.01M 枸橼

11、酸盐缓冲液 （pH6.0） 的修复盒中加热 20min 分钟，自然冷却后 PBS 溶液漂 洗3次（3 min/次）。滴加抗ECRG4蛋白一抗，保持4 C孵育一夜。PBS溶液 漂洗3次（3 min/次）后加入PV9000试剂，室温2025分钟，PBS溶液漂洗3 次再加二抗， 37 C 约 30 分钟。镜下观察 DAB 溶液的显色反应，直充分显色后 停止。然后用苏木素进行复染，持续510 秒，并分别用不同浓度（70%、85%、 100%）的乙醇脱水3 min，最后浸于二甲苯10分钟后封片。结果评定：0分: 组织未见染色；1 分：染色程度均呈现轻度染色或呈现为中强度但染色细胞比例 50%。并采用正常

12、组织评分分别减去癌组织评分、癌旁组织评分的差 值来判定是否存在ECRG4蛋白低表达，差值1 则为低表达明显（强阳性）。1.4 甲基化特异性 PCR1）DNA提取及亚硫酸氢盐修饰/纯化:按照说明书操作，采用GTpureTM组织DNA 提取试剂盒提取石蜡组织标本基因组DNA，以EpiTect Kit进行提取样本的亚硫 酸氢盐修饰与纯化，并于-20C条件下保存。2）引物设计及合成采用 MethPrimer 软件根据 ECRG4 基因序列分别进行特异引物的设计，具 体如下：甲基化弓I物：上游序列 MF： 5 -GTTTTGGAGTTTAGGGGTTGC-3；下游序 列 MR： 5 -AAAAAAATA

13、CGAACGAACAAACG-3；大小 180bp；非甲基化弓I物：上游序列UF： 5 -G-TTTTGGAGTTTAGGGGTTGTG-3；下游 序列 UR： 5 -AAAAAAAATACAAACAAACAAACAC-3；大小 170 bp。3）ECRG4 基因扩增：纯化 DNA 作为模板，采用 MSP-PCR 扩增。 PCR 反应反 应条件为：95C下预变性8min； 95C变性50 s，55C退火30 s，72C延伸45 s， 共 35 个循环4）判定标准：甲基化阳性：用甲基化弓物扩增出目的条带，分为完全甲基化（仅 有甲基化弓物扩增出相应片段）和不完全甲基化（甲基化弓物与非甲基化弓物均

14、扩增出相应片段）；甲基化阴性：仅用非甲基化引物扩增出目的条带。甲基化和 非甲基化的特异性引物均可扩增出相应的目标基因片段，无其他条带干扰，说明 该技术较可靠。1. 5 统计学分析采用SPSS 19.0软件完成数据整理及统计分析工作。根据数据具体的适用条件选用 2 检验或四格表精确检验行定量资料的组间比较（独立的两两比较）， P 0. 05 则差异有统计学意义。2. 结果2. 1 各组织中 ECRG4 基因表达情况HCC癌组织、癌旁组织、正常组织ECRG4蛋白低表达百分率分别为78.00%（40/50）和 44.00% （28/50）、9.68% （3/28）,肝癌组织、癌旁组织的 ECRG4

15、蛋白低表达百分率均明显高于正常组织的低表达百分率，肝癌组织 ECRG4 蛋白低 表达百分率高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P0.05）。表1 HCC组织中ECRG4蛋白的表达水平比较无低表达弱低表达低表达明显低表达百分率HCC癌组织（n=50）11291078.00%*a*b癌旁组织（n=50）2821144.00%*a*c正常组织（n=31）28309.68%*aHCC癌组织与癌旁组织比较差异有统计学意义;* bHCC癌组织与正常组织比较差异有统计学意义；*cHCC癌旁组织与正常组织比较差异有统计学意义。2.2 HCC 组织中 ECRG4 基因启动子区的甲基化情况 肝癌组织、癌旁组织、正常

16、组织 ECRG4 基因甲基化的检出率分别为 58%（29/50）、 32%（16/50）和 3.2（1/ 31）， 肝癌组织、癌旁组织均明显高于 正常组织，肝癌组织 ECRG4 甲基化的检出率高于癌旁组织，且差异均有统计学 意义（P0. 05）。表 2 HCC 组织中 ECRG4 基因启动子区的甲基化情况ECRG4基因甲基化ECRG4基因未 甲基化甲基化检出 率完全甲基化不完全甲基化HCC癌组织（n=50）2092158%*a*b癌旁组织（n=50）883432%*a*c正常组织（n=31）01303.2%2.3 ECRG4 基因表达及启动子区异常甲基化与 HCC 临床特征的相关性 结果显示在

17、癌组织的 ECRG4 基因甲基化与低表达百分比呈现明显的正相关 （p0.01 ）；在癌旁组织的 ECRG4 基因甲基化与低表达百分比呈现正相关（p0.05）。 见表 3。表 3 ECRG4 基因表达及启动子区异常甲基化与 HCC 临床特征的相关性低表达百分比（癌组织）低表达百分比（癌 旁组织）低表达百分比（正 常组织）rPrPrPECRG4甲基化检 出率0.8230.0080.5970.0440.1400.3094讨论肝细胞肝癌（HCC）是一类发病率较高的恶性肿瘤，且HCC基因组表现出复杂 性及多样性，因此，为了 HCC 的早期诊断、预后判断及靶向性治疗，加大对 HCC 中基因表达及基因改变的

18、研究具有重要的理论及临床意义4。目前，有关抑癌基 因的研究早已成为分子生物学和肿瘤遗传学领域的研究热点。近年来最新发现的 定位于正常人体染色体2q14.1-14.3、具有抑癌基因特征的ECRG4基因得到许多 肿瘤遗传学专家的关注o ECRG4基因是通过mRRNA差异显示技术从正常食管组 织和高癌家族中分离出的一条差异表达序列5。早期有研究表明 ECRG4 高表达 于大量正常组织中，但在食管癌组织及许多其他肿瘤组织中低表达，被初步认定 为候选抑癌基因，且认为 ECRG4 的表达过量能够抑制肿瘤细胞的生长增殖6。ECRG4 主要是通过启动子 DNA 甲基化过程参与基因表达调控， ECRG4 高甲

19、基化在胃癌、食管癌、鼻咽癌等多种恶性肿瘤组织中频繁出现 7-9。然而，对于 ECRG4 基因甲基化在肝细胞癌中的研究目前尚未有相关报道。本研究发现， 肝 癌组织、癌旁组织 ECRG4 蛋白低表达百分率分别为 78.00%（40/50）和 44.00% （28/50） ,明显高于正常组织蛋白低表达百分率（ 9.68%（3/28）； 肝癌组织、 癌旁组织 ECRG4 基因甲基化的检出率分别为 58%（29/50）、 32%（16/50），高 于正常组织ECRG4基因的3.2%(1/ 31),提示ECRG4基因在HCC中表达下调， 且其启动子区出现高甲基化，此结论与既往 ECRG4 基因在其他肿瘤中

20、的研究结 果大致相同。根据既往关于抑癌基因ECRG4的理论研究可发现ECRG4基因主要 是通过参与了 NF - KB 信号通路的转录激活，下调 NF - KB 通路的效应分子的表 达，阻断细胞的增殖，使细胞周期停滞于 G1-S 期10。本研究发现， ECRG4 基因在 HCC 组织中的表达下调与其异常甲基化表现为 明显的相关性，推测 ECRG4 基因的异常甲基化在 HCC 组织中具有肿瘤特异性， 可能导致ECRG4对NF - KB信号通路的调控失灵，HCC细胞增殖能力增强，与 HCC的发生、发展过程密切相关。因此，一定程度上，可以推测ECRG4基因可 作为HCC早期诊断的一种特异性指标，并辅助

21、性用于监测HCC的发生、发展。 最重要的是ECRG4基因可作为进一步研究HCC诊治的潜在分子标志物和治疗靶 点。因此，我们的研究中指出的ECRG4的低表达及高甲基化在HCC的发生、 发展中发挥了重要作用这一研究结果具有一定的理论与临床实际意义，当然，本 研究一定程度上受到实际条件的限制，样本量有限，日后还需要增加样本量来进 一步验证，其具体的分子生物学作用机理也值得进一步深入研究。4 结论ECRG4基因在HCC组织中表达明显高于癌旁组织和正常组织，这与ECRG4 基因启动子区的异常甲基化密切相关，并在HCC的发生、发展中发挥重要作用。 因此，可进一步探究 ECRG4 基因的抑癌作用，为探索肝细

22、胞肝癌的临床诊断与 治疗新途径提供新方向。参考文献阮嘉后，彭鹏，何坤，等肝癌缺失基因1在肝细胞肝癌中的表达及临床意义J.大 家健康,2016,10(21):1-2.2 李晓燕，高天慧，周云，等.重组人食管癌相关基因 4 蛋白的体外抑癌功能研究 J.中国现代药物应用,2012,6(21):8-9.3 王玉彬，巴彩凤.胃癌组织中食管癌相关基因 4 启动子区的甲基化及其临床意 义J.中国生物制品学杂志,2012, 25( 3):353-355.张真瑜.TIPE1在肝细胞肝癌中的作用及机制研究D.山东大学,2013.马尚林，李文梅，游颜杰.卵巢癌中ECRG4基因启动子甲基化的研究J.现 代肿瘤医学,2

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24、ry study of the effect of ECRG4 overexpression on the proliferation and apoptosis of human laryngeal cancer cells and the underlying mechanismsJ.Mol Med Rep,2015,12(4) : 5058-5064.8 Baird A， Lee J， Podvin S， et al Esophageal cancer - related gene 4at the interface of injury ， inflammation ， infectio

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