《分子医学实验学》word版

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1、分子医学实验学实 验 指 导供口腔、护理、药学各专业用 （第一版）佛山科学技术学院医学院编2008年6月编 写 说 明分子医学实验学是一门集生物化学、免疫学、生物化学技术和分子生物学基本实验、科研探索和医学应用于一体的全新的综合性实验课程。其实验技术反映现代生物医学发展趋势。分子医学实验是基础医学实验教学的重要组成部分，是医学各本科专业的专业基础必修课。课程内容包括分子医学基本实验技术、基础实验及综合和设计性实验等部分。课程的主要目的一是强化基础知识教育，突出基本技能训练，是使学生能掌握分子医学的经典理论和基本实验，二是培养学生综合性素质，开发学生的科研潜能和创新思维。开设分子医学实验学的目的

2、在于：1、验证和巩固理论知识，加深对理论知识的全面理解，加强记忆。2、通过实验，掌握分子医学实验学的基本操作技术，掌握层析法,电泳法,分光光度法和生物大分子制备等常用的实验方法的基本原理，熟悉分子医学实验的一般知识。3、培养学生观察、比较、思考及分析问题和解决问题的能力，使学生具备一定的动手操作能力、创新能力培养学生科学、严谨、认真工作态度及理论联系实际、实事求是的工作作风。本实验指导11个实验项目涵盖了分子医学实验学中沉淀、离心、层析、电泳、分光光度测定等分子医学实验的基本方法，可依实验所需时间作合理组合实验，根据实验条件和教学安排适时开课。 实 验 室 规 则1实验前必须预习实验指导和相关

3、理论知识，明确实验目的、原理、预期的实验结果、操作关键步骤及注意事项，计划安排实验工作时间。2 穿白大衣准时进入实验室，保持实验室整洁安静，不得谈笑和大声说话，不准做与实验无关的事情。3实验时应持“三严”作风态度严谨、思维严密、操作严格。实验中认真、仔细观察实验过程中的实验现象和结果，及时如实的做好原始记录。实验失败须重做。根据实验结果进行科学分析，写好实验报告，交指导教师批阅。4注意安全，不得擅自离开。使用易燃、易爆、有毒试剂和材料进行实验时，应严格遵守操作规程，防止火灾、中毒、污染、触电等事故发生，一旦发生，果断处理并立即报告教师5 爱护公物，防止损坏，若有损坏及时报告原因并登记。公用仪器

4、就原处使用，了解使用方法及遵守操作规程，使用后必须在仪器登记本上登记并签名。公用试剂就近量取、用毕随时放回原处。要节约水、电、煤气及试剂药品6实验结束，洗净器材，清整实验室，打扫卫生，检查门、窗、水、电和煤气的安全。目 录实验一 实验室基本知识和技术 （5） 实验二 蛋白质浓度测定（双缩脲法） （21）实验三 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质 （23）附：电泳技术 （27）实验四 血浆清蛋白的分离纯化与鉴定 （35）附：层析技术 （37）实验五 胰岛素及肾上腺素对血糖浓度的影响 （45）实验六 脱氧核糖核酸（DNA）的提取及成分鉴定 （48）实验七 质粒DNA提取与纯化 （51）实验八 DNA重

5、组质粒的设计与构建 （54）实验九 凝集试验 （61）实验十 肝功能组合实验 （65）附1：血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定附2：酶联免疫吸附试验（ELISA） 实验十一 免疫血清的制备 （71）实验一 实验室基本知识和技术 （The basic knowledge and technology of lab）【目的和要求】1 掌握各种基本的生化技术、常用仪器的分类、使用及注意事项2 熟悉生化实验室规则3清点洗刷实验用具。【实验内容】1 实验室规则2 生物化学实验各种基本技术3 722型分光光度计的使用4 实验记录和实验报告【仪器、设备】1.烧杯2.试管3.刻度吸量管4.离心管5.滴管6.搅

6、棒7.枪式移液器及其配适吸头8.混匀器9.恒温水浴箱10.离心机11722型分光光度计，721型分光光度计第一部分 基本知识与操作一、常用的玻璃仪器（一） 分类：常用的玻璃仪器分类有量器和容器，“量器”主要包括：量筒、量杯、容量瓶、吸管等。“容器”主要有烧瓶、烧杯、试管、试剂瓶、离心管等。量器有量入式和量出式两种形式。“量入式”用“”、“”、“”表示，定量标记由下往上递增，测量注入量器中的液体；“量出式”用“TD”、“A”表示；定量标记由上而下递增；测量从量器中倾出的液体。（二）玻璃仪器的洗涤、干燥1、洗涤液：洗洁精，肥皂水，洗衣粉。玻璃仪器专用洗涤液：主要成份为中性稀氯氧化剂，上海日化研究所

7、出品2、洗涤的要求与步骤：要求：洁净的玻璃器皿表面应不挂任何水滴。步骤： 不净的器皿 洗衣粉或肥皂水刷洗 自来水冲净达到要求？ 是 浸入洗液(数小时至过夜) 自来水冲净 蒸馏水涮洗23次(其目的是去除自来水中的杂质，故应少量多次，全面充分)烤干或晾干、备用 注意：对使用过的仪器应养成及时清洗的习惯，特别是血液分析时用以吸取血液样本的吸管，用过后应当立即用水将所沾的血液冲去，否则放置过久，血液干燥硬结，就很不容易清除。 新购置的玻仪：合成洗涤剂洗刷0.2mol/L盐酸浸泡（去除游离碱）小时自来水冲洗冲洗次。一般容器：如试管、烧杯、三角烧瓶等。流水冲洗合成洗涤剂洗刷自来 水多次冲洗冲洗。容量分析仪

8、器：如吸管、容量瓶、量筒、滴定管等。使用后立即浸泡水中。 自来水多次冲洗沥干铬酸洗液浸泡数小时自来水多次冲洗冲洗次。（不能刷洗）比色杯：用毕立即用反复冲洗。洗不净时，用盐酸冲洗，再用自来水冲洗和蒸馏水冲洗。避免用碱液或强氧化剂清洗，切忌用试管刷或粗糙纸试擦3、玻璃仪器的干燥 一般的玻璃仪器均可洗净后倒置架上，让其水分蒸发自然干燥，如需迅速干燥者应按仪器的不同类型按下述不同方法处理： 试管、离心管、烧杯、烧瓶等普通玻璃器皿可置烤箱中100105烘烤 少量仪器如需急用也可在电炉上或酒精灯上烘烤。烘烤时应将器皿时时转动，务使受热缓慢且均匀，并将管口(或杯口)倾斜向下，以便水蒸气冷凝成水滴，顺口流出，

9、不致使水滴接触烘热了的器壁而使仪器爆裂。 使用电吹风干燥一般玻璃仪器也很便利常用。 下列玻璃仪器应避免烘烤：各种计量玻仪：不可烘烤，自然干燥（容易造成器壁变形而致容量不准）。常用定量吸管很难自然干燥，可在至烘箱烤干。厚壁玻仪（研钵、量筒比色杯：等）及结构复查的玻仪：易在烘烤时发生破裂，不可烘烤，自然干燥。（自然干燥适应于不急于使用和各种计量玻仪；烘烤干燥除结构复杂、厚壁及计量玻仪外，均可。温度在，刻度吸管温度应小于。）二、 常规操作技术及注意（一）移液操作 用于移液操作的有奥氏吸管、移液管、刻度吸管三种吸量管及枪式移液器。三 种 吸 量 管 比 较 奥氏吸管 移液管 刻度吸管 特点 管中有一球

10、形膨起 管中有棱形膨出 直筒状 只有一个刻度 只有一个刻度 有多个刻度 准确度 最高 次之 再次之 应用 适用于吸取标准液 吸取标准液 生化实验中广泛使用 或粘稠性血标本 管尖液 吹 不吹 吹（完全流出式） 停留15秒 不吹（不完全流出式） 流速 愈慢愈好 慢流出 快流出1、吸量管的使用 吸量管的选择：在一次完成转移的前提下，应选用容量较小的吸量管对于同一次实验中同一种试剂的移取，应选用同一支吸量管操作(见图11) 用洗耳球将液体吸至超过标线移开洗耳球，迅速用食指压紧管口必要时将管尖端外围拭净调液面至标线放开食指，使液体流入容器将最后液滴沿器壁而下或吹出读数(见图12)吸量管保持垂直视线与液面

11、应水平管中液面与刻度线应呈切线使用注意：持管方式；管尖插入液面的深度；吸液；读数（认刻度，准确读数，注意无色液与有色液读数之区别）；放液（吹与不吹之分，注：对于刻度由上至下的吸量管应尽量使用上端刻度管尖残液是否需吹出，看清标记）。2、枪式定量移液器的使用抢式移液器的结构(见图3) （1. 液体吸放钮2体积选取钮3. 体积、显示4枪头排放钮5. 枪头排放器6枪头接嘴）其内部柱塞分2段行程，第1档为吸液，第2档为放液，手感十分清楚。 种类： 固定式和可调式 规格： 0.510000ul不等操作(见图14)正式使用之前，要连续按动数次，使管内空气同工作环境空气交换，保持管内工作负压恒定 调体积选取钮

12、至所需值，在移液管下端插上塑料吸嘴，轻轻扭转以保证所密 垂直持握枪式移液器外壳，按下大拇指至第1档 将吸嘴垂直地浸入所需取样液内，深度为23毫米，徐徐松开大拇指，使之返回原来位置。 停留12秒，平缓地将移液管取出，同时应避免吸嘴与任何东西碰撞。 将吸液嘴移至加样容器壁上，缓慢按动按手至第一档，将液体排了。停留1秒（粘性较高的溶液停留时间可长些）。紧接着再将按手按至第二档，排出吸嘴里的全部液体。（要求动作连 ）。 完全排出液体后，小心地连同吸嘴沿着容器壁向上滑动取出。再放松按手，使之返回原来位置，即完成一次操作。如需移取另一样品，按枪头排放钮，更换枪头注意：移液器是精密量取，不允许将移液器直接与

13、液体接触。不使用时也应插上塑料吸嘴，以免液体或染色液吸入移液器内，导致阻塞。移取过程中应控制速度，力度。塑料吸嘴可经受100高温高压消毒。（二）混匀操作(1)旋转法：手持容器，使溶液作离心旋转(2)指弹法：一手执试管上端，另一手轻弹试管下部，：使其中液体作涡旋运动。(3)搅动法：使用玻璃棒搅边；多用于溶解烧杯中的固体。(4)混匀器法：将试管置于混匀器的振动盘上，逐渐用力下压，使内容物旋转。(5)倒转混匀：适用于具塞的容器，如容量瓶、具塞量筒及具塞离心管等。操作时，将容器反复倒转。试管内的液量太多，也可利用倒转混匀法，外面包以玻璃纸塞住管口，然后用手指按住橡皮塞将试管反复倒转，溶液即可充分混匀。

14、(6)吸管混匀法：用吸管将溶液反复吸吹数次，以达到混匀的目的。（三）加热与保温操作1、加热(见图15；图16)2、保温使用恒温水浴箱，调节温度设定钮至需要的温度。水浴箱中水要足量。实验过程中应随时监测温度，并及时调节。（四）离心操作离心沉淀法：当颗粒小而不均一，沉淀粘稠或容积小又需精确定量时，往往采用离心沉降法。1、离心前检查：取出所有套管，起动空载的离心机，看是否转动平稳。检查套管有无软垫，是否完好，内部有无异物。离心管与套管是否匹配。 2、平衡： 将一对离心管放入套管，置于天平两侧，用滴管较轻一侧的离心管与套管之间加水至两侧平衡(离心管及其内溶液量不能差别过大)3、离心：将等重的两管置于离

15、心机中的对称位置，调转速调节钮，逐渐增加转速至所需值，计时，离心结束后，将套管中的水倒净，所有套管放回离心机中。4、使用注意根据需要选择合适的转速、时间；选择合适的离心管，做到对称平衡；启动时应由低速慢慢加至所需速度离心结束关机后，应让其自然停止，不可用手或其它物品强迫停止（五）点收仪器根据仪器清单，逐项查点是否完好(如有缺损向教师声明及时补充更换)第二部分 分光光度法当光线通过透明溶液介质时，其幅射能量有部分被溶液吸收，一部分透过，所以光线射出溶液介质之后光能被减少。对溶液来说，溶液呈现不同的颜色，是由于溶液中的质点(分子或离子)选择性地吸收某种颜色的光所引起的。如果各种颜色的透过程度相同，

16、这种物质就是无色透明的，若只让一部分波长的光透过，其它波长的光被吸收，则溶液就呈现出透过光的颜色，并与被吸收的光的颜色完全互补。任何一种溶液，对不同波长的光的吸收程度是不相等的，一些有色物质可以选择性地吸收一部分可见光区的光的能量而呈现不同颜色，一些物质却能特征性地选择吸收紫外线的能量。物质吸收由光源发出的某些波长的光可形成特定的吸收光谱。由于物质的吸收光谱与物质的分子结构有关，而且在一定条件下其吸收程度与该物质的浓度成正比，所以可利用物质的特定吸收光谱对其进行定性和定量分析。分光光度法是利用各种物质所具有的这种吸收特征所建立起来的分析方法。一、分光光度分析法的基本原理 劳伯比尔定律(Lamb

17、ert-Beerlaw)是讨论吸收光能与溶液浓度和溶质层厚度之间关系的基本定律，是分光分析的理论基础。 劳伯比尔定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体（一）Lambert氏定律 一束单色光通过透明溶液介质时，光能被吸收一部分，被吸收光能的量与溶液介质厚度有一定比例关系(见图21)。表达式为 这里I0为入射光强度 I为通过溶液介质后的光强度 L为溶液介质的径长(path length) k为吸光系数(absorption coefficient)(gcm-1)（二）Beer氏定律 以溶液介质浓度变化代替溶液介质厚度的改变，光能的吸收与浓度改变有类同的关系，即一束单色光通过溶液介质时，

18、光能被溶液介质吸收一部分，吸收多少与溶液介质浓度有一定的比例关系。得出下式： 这里C(Concentration)为溶液介质的浓度(gL-1)将Lambent氏定律和Beer氏定律合并，即(1)和(2)合并为式中A(Absorbance)为吸光度 T(Transmittance)为透光度(4)式也可表达为 A=Cb.(5)式中(epsilon)称之摩尔吸光率(Molar absorptivity)(molL-1cm-1) C(concentration)浓度(molL) b(path length)溶液样品的长度cm(或比色皿内径长cm) (5)式为lambertBeer定律的物理表示式，其含

19、义为一束单色光通过溶液介质后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。此式为分光分析法的基本计算式。 如果实验中溶液厚度b=lcm则A=C图22表明，在溶液介质厚度一定的情况下，吸光度(A)、透光度(T)和溶液介质浓度(C)之间的关系。摩尔吸光率()实际上是物质在单位浓变和单位厚度下对入射光的吸光度，在一定波长下，越大表示物质对光的吸收越强。二、分光光度法的定性定量方法许多对光有吸收的物质可以直接用分光光度法进行定量分析：一些对光，包括紫外、可见或近红外都无吸收的物质亦可通过和某些化学试剂作用而呈色，在一定的反应条件下和一定的浓度范围内，溶液颜色的深浅(对光吸收的程度)和该溶液中显

20、色物质的浓度呈正比。(一)测定波长的选择 使用分光法测定溶液中物质的含量，首先要选择最适单色波长，因为只有以能被溶液吸收的光束作为入射光才能符合LambertBeer定律。测定有色物质时，不同颜色的待测溶液，则应选择不同波长的单色光束。在分光光度计上，单色光波长的选择原则一般是使被测溶液的单位浓度的吸光度变化最大，同时还要具有最小的空白及干扰读数，借以获得最高的灵敏度和正确性。最理想的办法是对每种物质的测定都应先傲它的光谱吸收曲线及有关干扰物的吸收曲线，根据这些光谱吸收曲线来选择最佳测定波长。表22可供波长选择的参考。(二)分光光度法定量方法1、利用标准管计算测定物含量最适波长选定以后可进行溶

21、液物质含量的测定。通常都采用对比测定法，即以巳知精确含量的待测物质的溶液作为参考标准物(Cs)和未知待测样品(Cx)用同一方法，在同一条件下、同时进行测定，读取标准物质的吸光度(As)和未知含量的样品吸光度(Ax)，由于标准物质和未知物质是同一物质，其摩尔吸光率(巨)相同和进行测定用的比色皿内径长(b)相同即bs=bx，根据A=Cb式，可得到 As=Cs 换算成下式 Ax=Cx 式中Cs是标准管中物质的实际含量，是标准液的浓度与实际用量的乘积；Cx是测定管中物质的实际含量。还应换写到法定单位mmolL、mgm1。2、利用标准曲线进行换算配制一系列不同浓度的标准的溶液(至少五个)按测定管同样方法

22、处理显色，在选定的波长分别测定各管的吸光度(A)，以吸光度为纵坐标，标准溶液的浓度(C)为横坐标，在方格坐标纸上作图，制作标准曲线。以后在同样条件下进行测定时，测定被测溶液的吸光度，从标准曲线上可找出相应的浓度。根据LambertBeer定律，标准液的浓度在一定范围内与吸光度呈直线关系，标准曲线是这种直线关系的描述，一般认为，标准曲线范围在测定物浓度的一半到二倍之间，并使吸光度在00510范围内为宜。 还须注意：曲线制作与测定管的测定应在同一仪器上进行，由于曲线的建立与实验室当时的条件如温度，湿度和气压及电压稳定性等有关，因此标准曲线常因各种变化而需校正或重做。3、摩尔吸光率求取测定物浓度当浓

23、度为1ML时，溶液厚度为1cm，吸光率用表示，在已知测定物的，则可根据下式求得测定物的物质浓度。此计算法常用于紫外吸收，如核苷酸溶液含量测定，如UTP在262nm具有最大吸收峰，利用已知UTP在262nm时的摩尔吸光率，读取待测UTP溶液吸光度A，即可求出该UTP浓度。二种以上被测物的混合液，也可利用不同进行定量测定。例如a，b两种物质在波长1时，摩尔吸光率分别为a1和b1：，在波长2时摩尔吸光率分别为a2和b2，a和b混合的溶液在1时吸光度为Al，在2时的吸光度为A2(图23)，各自浓度分别为Ca和Cb，则 如有三种以上成分的混合液，也可通过三种不同波长情况下的吸光度，以各自特有的值，依据三

24、元一次方程，同样可求出未分离的三种混合物的各自浓度-（三）、物质的定性分析以不同波长的单色光作为入射光，测定某一溶液的吸光度，然后以入射光的不同波长为横轴，各相应的吸光度为纵轴作图，可得到溶液的吸收光谱曲线。吸收光谱曲线是物质的特征性曲线，它和分子结构有严格的对应关系故可作为定性分析的依据。不同的物质，分子结构不同，其吸收光谱曲线也有其特殊形状(图24)。在吸收光谱中，往往可以找到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大吸收波长(入max)。物质不同，它们的波长(nm)最大吸收波长也往往不同，图14为维生素B12溶液的吸收光谱曲线。物质用分光分析定性主要依据吸收光谱存在的特征吸收。比较吸收光谱

25、曲线，在相同情况下，吸收光谱曲线不同，表明物质的化学结构不同，因为不同的物质有各自的特征性曲线。如ATP和GTP都属于核苷酸，它们的溶液在紫外光区均有吸收，但由于化学结构不很一样，它们的吸收光谱就有差别。需要注意的是在不同条件(如选择不同溶剂)下，即使是同一物质也可呈现不同的吸收光谱。比较最大的吸收波长。不同的物质可有不同的最大吸收波长(kmax)。如ATP、GTP、CTP和UTP的max分别为259nm、253nm、271nm和262nm。Lnlax可作为物质定量测定的最适波长，此时测定灵敏度最高。有些物质化学结构相近，可产生相同的max，伹它们的吸收系数都不一致，可据此鉴别之。 比较吸光度

26、比值。可根据物质两个或几个不同波长的吸光度比值来鉴别不同的物质，同时也可检查物质的纯度。如DNA溶液kmax为260nm。在260nm的吸收度和在280nm的吸收度比值为18。但溶液中混进了蛋白质，则比值会降低(蛋白质在280nm处有最大吸收)。三、分光光度计基本结构与使用分光光度计的类型很多，最常用的是可见分光光度计和紫外可见分光光度计。各种类型的分光光度计的结构和原理基本相同，一般包括光源、单色器、比色杯、检测器和显示器几大部分。光源 单色器 狭缝 吸收杯 检测器 显示器 卤钨灯 滤光片 玻璃杯 将光信号 检流计 氢灯 棱镜 石英杯 转换为电信号 微安表 光栅 （光电管和 数字显示器 光电

27、倍增管）（一）光源一个良好的光源要求具备发光强度高、光亮稳定、光谱范围广和使用寿命长等特点。可见光分光光度计常用的光源是采用稳压调控的钨灯(tungsten lamp)，能发射出350nm2500nm 波长范围的连续光谱，适用于340-900nm范围的光源。现在常用的卤钨灯。紫外光光度常用氢灯(hydrogen lamp)作光源，其发射波长的范围为150nm400nm。它适用于做200 -360nm的紫外分光分析。（二）单色器将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分光系统或单色器。分光光度法测定某一物质的吸光度需要在某一特定波长下进行，单色光器的作用在于根据需要选择一定波长范围的单色光。在实

28、际工作中欲选择出单个某波长的光线是困难的。所谓单色光是指在此波长有最大发射，而在相邻较长和较短波长范围内的发射能量较少而言。单色光的波长范围愈窄，仪器的敏感度愈高，测量的结果愈可靠。单色器可分为滤光片、棱镜和光栅。滤光片可分为吸收滤光片、截止滤光片、复合滤光片和干涉滤光片。棱镜是用玻璃或石英材料制成的一种分光装置。其原理是利用光从一种介质进入另一种介质时，光的波长不同在棱镜内的传播速度不同，其折射率不同而将不同波长的光分开。见图24通过单色光器的发射光的强度可能过强也可能过弱不利于进一步检测。狭缝是由一对隔板在光通路上形成的狭缝。通过调节狭缝的大小来调节入射单色光强度并使入射光形成平行光线，以

29、适应检测器的需要。光电比色计的狭缝是固定的，而光度计和分光光度计的狭缝大小是可调的。（三）比色杯比色杯又吸收杯，是光度测量系统的最重要部分之一。在可见光范围内测量时选用光学玻璃吸收杯，在紫外线范围内测量时要选用石英吸收杯。比色杯的光径0.110cm，一般为1cm。注意保护比色杯的质量是取得好的分析结果的重要条件之一。不得用粗糙、坚硬物质接触吸收杯，不能用手指握取吸收杯的光学面；用后要用水及时冲洗，不得残留测定液，尤其是蛋白质和核酸溶液。（四）检测器硒光电池、光电管或光电倍增管等光电元件常用来作为受光器，将通过比色杯的光信号转变成电信号。进一步再用适当的方法测量所产生的电流。（五）显示器 显示器

30、是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的装置。常用的显示器是有检流计、微安表、记录器和数字显示器。四、几种常用的国产分光光度计（一）721型分光光度计 该机光谱范围在360800nm(可见光区)，该机灵敏度较高，而且结构简单，操作方便，可用于有色物质溶液的测定。1、721型分光光度计光路图和外形图2、使用方法开启电源，指示灯亮，选择开关置于“T”，波长调置测试用波长。仪器预热20分钟。打开试样室盖(光门自动关闭)。调节“0”旋钮，使数字显示为“000”盖上试样室盖，将比色皿架处于蒸馏水校正位置，使光电管受光，调节透光率“100”旋钮，使数字显示为“100.0”。 将选择开关置于“A”

31、。调节消光零旋钮，使得数字显示为“000”，然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度的值。如果大幅度改变测试波长时，在调整“0”和“100”后稍等片刻，(因光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间)，当稳定后，重新调整“0”和100即可工作。每台仪器所配套的比色皿，不能与其它仪器上的比色皿单个调换。换一波长测试时，应将选择开关置“T”，重复(2)和(3)操作。测试完毕，关闭开关，电源，将比色皿冲洗干净。 (三)UV754型紫外分光光度计1、UV754紫外分光光度计光路图：由光源发出的连续辐射光线，经滤光片和球面反射镜至单色器入射狭缝处聚焦成像，光束通过入射狭缝，经平

32、面反射镜到准直镜，产生平行光射至光栅。在光栅上色散后，又经准直镜聚焦在出射狭缝上成一连续光谱，由出射狭缝射出定波长的单色光，通过标准溶液再照射到光电管上。光源切换与波长移动相对应 200nm-290nm需点亮氘灯290nm一360nm需同时点亮氘灯和钨灯360nm-850nm需点亮钨灯单色器采用自准式系统，衍射光栅使用该厂自制1200条nm的复制闪跃光栅2、测试准备(1)打开电源开关之前，检查一下测试样品室。(2)试样槽置“参考”位置。(3)打开电源开关。如果波长工作在200nm一300nm时需按氘灯触发按钮。(4)显示器显示754”后，数显为“1000”，则表明仪器已通过自检程序。此时按AC

33、键，仪器自动进入“0000吸光值状态，测试“连续”及“自动”打印状态；(5)仪器预热三十分钟。3、测试(1)数显“0000稳定后，即可把试样槽置于“样品”位置进行测试(即拉一下样品室滑杆)。待第一个数据自动打印完毕后，再可将试样槽置于第二个“样品”位置测试(即再拉一下样品室滑杆)。(2)每当需要调换波长时，必须把试样槽置于“参考”位置，重新调零，现将测试操作顺序如下： 注意：样品号超过99号，打印数复位至00继续计数下去。(四)分光光度计和紫外分光光度计使用注意事项光度计的光电管或光电池对不同浓度的光敏度不一样，应注意每换一次波长，即应将空白溶液的吸光度调整到0。溶液定量测定，应注意吸光度在0

34、0510范围，浓度太大时应该适当稀释。一般灵敏度旋钮调置“1”档，因其放大倍率最小，较稳定。第三部分 实验记录和实验报告实验记录是实验结果和经验的综合记载，是分析实验结果和书写实验报告的依据。而实验报告是全部实验的根据和总结。两者都十分重要。学生应备有实验记录本和实验报告本一、实验记录1书写整洁、字迹清楚2记录实验中观察到的实验现象、实验结果和实验数据。原始记录必须真实、客观、准确、祥细、清楚，切不可夹杂主观因素3实验中使用的仪器类型、试剂规格、化学反应、分子式及浓度，都应记录清楚4完整的实验记录应包括日期、实验项目、目的要求、操作和结果等二、实验报告实验结束后，应及时整理实验记录，总结实验结

35、果，写出实验报告。实验报告应包括以下项目：(1)实验名称(2)目的和要求(3)原理(简述实验的基本原理)(4)操作(可以采用流程图的方式或以表格方式表示)(5)结果与讨论 描述实验出现的现象和结果，分析它们所说明的问题，探讨实验成败的关键。阐述对实验设计的改进意见等。对于定量实验列出算式进行计算并对实验结果进行必要的说明和分析。(6)思考题 实验二 蛋白质浓度测定（双缩脲法）【目的和要求】1 掌握本实验方法的原理和操作2 掌握标准工作（AC）曲线的制作3 熟悉蛋白质定量测定的几种常用方法【实验内容】1分光光度计的使用2标准曲线的绘制3血清蛋白质含量测定【试剂与器材】16molL氢氧化钠溶液 称

36、取氢氧化钠(NaOH，优级纯)240g，用新鲜蒸馏水配制成1L，置室温贮存在密封的聚乙烯瓶里。2双缩脲试剂 称取未失结晶水的硫酸铜(CuSQ5H20)30g，溶于500m1新鲜蒸馏水中，加酒石酸钾钠(NaKC4H4O6。4H2O)90g，碘化钾(KI)50g，待安全溶解后，加入6molL氢氧化钠溶液100ml，最后加蒸馏水至1L。室温贮存在密闭的聚乙烯瓶里，约稳定6个月。3蛋白标准液 可用商品血清蛋白标准液或定值质控血清为标准。亦可收集混合新鲜血清，用凯氏定氮法标定后，加叠氮钠防腐(叠氮钠的终浓度0510gL)，冰冻保存。4恒温水浴箱、722（721）分光光度计、吸管、试管、坐标纸【实验原理】

37、测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有凯氏定氮法；比色法主要包括双缩脲法、Folin-酚试剂法及 染料结合法；紫外分光光度法等双缩脲(Biuret)法：在碱性溶液中，双缩脲(H2NCONHCONH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(CONH2)，或与此相似的基团如CH2NH2，CSNH2，C(NH)NH2的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(CONH)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。与同样处理的蛋

38、白标准液比较，经计算或查标准曲线即可求出血清总蛋白质含量。【操作】1.配制20gL蛋白标准液 如蛋白标准液浓度为70gL，则取此液2m1，加入新鲜蒸馏水5ml，混匀即成。2.按表操作加入物（ml）空白管12345测定管20g/L蛋白标准液0.10.20.30.40.5蒸馏水0.50.40.30.20.10.4待测样品液体0.1双缩脲试剂3.03.03.03.03.03.03.0相当血液蛋白质（g/L）20406080100混匀，置37水浴10min(或2530min)，用540nm波长比色，以空白管调零，读取各管吸光度。3、标准曲线绘制15为标准曲线管，测得吸光度后，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓

39、度为横坐标绘制标准曲线。4、实验结果 根据测定管吸光度，从标准曲线查找相对应的总蛋白浓度。【注意事项】1双缩脲试剂中，加入酒石酸钾钠，Cu2+形成稳定的络合铜离子，以防止CuSO45H20不稳定形成Cu(OH)2沉淀。酒石酸钾钠与CuSO45H20之比不低于3：1，加入KI作为抗氧化试剂。2双缩脲试剂要封闭贮存防止吸收空气中的二氧化碳。3本法各种蛋白质的显色程度基本相同，重复性好，几乎不受温度影响，唯一缺点是灵敏度较低。4黄疸血清严重溶血对本法有明显干扰。5本法绘制的标准曲线是一条通过原点的直线，在100g/L浓度之内呈良好的线性关系。 思考题： 1双缩脲法测定蛋白质的原理是什么?其他还有什么

40、方法测定蛋白质的含量?2请用双缩脲法，设计一个测定蛋白质含量的定量方法(除标准曲线法外)。实验三 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质(Serum albumin separated by acetate film electrophoresis）【目的和要求】1掌握醋酸纤维素薄膜电泳的原理和操作方法1 了解醋酸纤维素薄膜电泳所分离的血清蛋白质的各带谱及其临床意义。【实验内容】血清蛋白质电泳醋酸纤维薄膜法1 仪器和薄膜的准备2 点样3 平衡和电泳4 染色5 结果判断6 透明7 定量分析【器材】1仪器：电泳仪、电泳槽、分光光度计或光密度仪。2材料：醋酸纤维薄膜、培养皿、滤纸、镊子、点样器、直尺、铅笔、

41、剪刀等。【试剂】1巴比妥巴比妥钠缓冲液(pH8.6，m=0.06)。称取巴比妥2.21克和巴比妥钠12.36克，溶于500毫升蒸馏水中，加热溶解。待冷至室温后，再加蒸馏水稀释至1000毫升。2染色液丽春红S染色液：称取丽春红S O.4g、三氯醋酸6g，用蒸溜水溶解并稀释至100ml。氨基黑10B染色液：称取氨基黑（C22H13O12N6S3Na3）10B 0.1g,溶于20ml无水乙醇中，加冰醋酸5ml,使其溶解。另取磺基水杨酸2.5g，溶于少量的蒸馏水中，加入前液将两液混合摇匀，再以蒸馏水补足至100ml。称取丽春红S0.4克及三氯醋酸6克；用蒸馏水溶解，并稀释至100毫升。3漂洗液。（1）

42、3（VV）醋酸溶液：适用于丽春红S染色的漂洗。（2）甲醇45ml、冰醋酸5ml、蒸馏水50ml混匀，适用于氨基黑10B染色的漂洗。4透明液 取无水乙醇75毫升和冰醋酸25毫升混匀备用。5 洗脱液（1）0.1mol/L NaOH溶液：用于丽春红S染色的洗脱。（2）0.4mol/L NaOH溶液：用于氨基黑10B染色的洗脱。640%(VV)醋酸溶液。【实验原理】带电荷的蛋白质，在电场中向着与其所带电荷电性相反的电极泳动称为电泳。血清中各种蛋白质的等电点不同，但大都在pH7以下，若将血清置于pH8.6的缓冲液中，则这些蛋白质均带负电，在电场中都向阳极移动。由于各种蛋白质在同一pH环境中所带负电荷多少

43、及分子大小不同，所以在电场中向阳极泳动速度也不同。蛋白质分子小而带电荷多者，泳动速度快；反之，则泳动速度慢。因此可将血清蛋白质依次分为清蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、b-球蛋白和g球蛋白五条区带，经染色可计算出各血清蛋白质含量的百分数。以醋酸纤维薄膜（CAM）为支持介质，电泳分离后经染色处理，可展示出清晰的蛋白质电泳图谱。由于染色时染料与蛋白质的结合与蛋白质的量成正比，因此将各蛋白质带剪下，分别用一定量的NaOH稀溶液洗脱下来，即可进行比色，测定出各蛋白质区带的相对含量。也可用一定量的有机溶剂使CAM溶解制成透明膜而用光密度计进行扫描定量。醋酸纤维薄膜电泳具有微量、快速、简便及分辨率较高等

44、优点，广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、同工酶的分离和测定。【操作】 1、电泳槽的准备 将巴比妥巴比妥钠缓冲液加入电泳槽中（两侧槽内注入等量的缓冲液），调节两侧内的缓冲液，使其在同一水平面，液面与支架的距离约为22.5cm。支架宽度到恰好适合CAM的长度，用34层滤纸或4层纱布搭桥。 2、CAM准备 取醋纤薄膜(2厘米*8厘米)在CAM的无光泽面（涂有醋酸纤维素）距一端1.5cm处用直尺和铅笔轻划一线（与CAM的长轴垂直），作点样标记，将膜条编号后将无光泽面朝下浸入巴比妥巴比妥钠缓冲液中，待充分浸透后取出（一般约需求2030min）,夹于洁净的滤纸中,吸去多余的缓冲液.3、点样 用血清加样

45、器将35ul无溶血的新鲜血清均匀地点在划线处，样品应与膜的边缘保持一定距离，以免电泳图谱中的蛋白区带变形。待血清渗入膜后移开点样器。点样应注意，要适量、均匀和垂直，并避免弄破薄膜。4、平衡 将已点样的薄膜加样面朝下，点样端置于阴极端，将膜条紧贴于电泳槽支架的盐桥上并保持平直，桥的另一端垂入缓冲液中，盐桥将膜的两端与缓冲液连通，加上槽盖平衡5min后通电电泳。5、电泳 正确联接电泳槽与整流器对应的正负极，点样侧接负极，另一侧接正极。开启电源通电。调节电压10V15V/cm膜长,电流0.40.6mA/cm膜总宽，电泳4060分钟（通常夏季需45min,冬季需60min），待电泳区带展开3.5cm4

46、cm时即可关闭电源。 6、染色 通电完毕，立即取出薄膜直接浸入丽春红S或氨基黑10B染色液中，染色510分钟。7、漂洗 至少准备34个漂洗皿，装入漂洗液。从染色液中取出薄膜条并尽量沥去染色液，按顺序投入漂洗液中反复漂洗，直至背景漂白为止。此时清晰可见5条色带。待干。7、定量 （1）洗脱比色法 取六支试管，分别标明“A、1、2、空白”。将漂洗净的薄膜剪下各区带放入相应的试管内，另从空白背景剪一块平均大小的膜条置于空白管中，根据染色不同按以下方法洗脱。 氨基黑10B染色洗脱：6支试管于清蛋白管内加入0.4mmol/L NaOH溶液6ml,其余5管各加3ml，振摇数次，置37水浴20分钟，使色泽完全

47、浸出。用620nm波长，以空白管调零，读取各管的吸光度，其中清蛋白管吸光度2。 丽春红S染色洗脱：洗脱液用0.1mmol/L氢氧化钠溶液，加入量同上。10分钟后，于清蛋白管内加入40（VV）醋酸0.6ml，其余5管各加入0.3ml，以中和部分氢氧化钠，使溶液色泽加深。如出现沉淀，可离心取上清液比色。用520nm波长，以空白管调零，读取各管的吸光度，其中清蛋白管吸光度2。（2）光密度扫描法 1）透明：将已漂净吹干的CAM条浸入透明液中35分钟，取出平铺于洁净干燥玻片上（应无气泡），直立片刻除去过多的透明液。于90100烘箱内烘烤510分钟，取出冷却至室温。此法透明的CAM，各蛋白区带鲜明，薄膜平

48、整，可直接扫描或作永久保存。若用十萘氢或液体石醋透明，应将漂洗过的薄膜烘干后进行透明，透吸后的薄膜不能久藏，易发生皱折。 2）扫描定量：将已透明的薄膜放入全自动光密度计或其它光密度扫描的光路，选择波长520nm，描记各蛋白区带峰，并计算各蛋白成分的相对含量。 8、计算定量计算时，先计算各光密度值的总和：再计算血清各部分蛋白质所占的百分率吸光度总和（T）2A12（吸光度） Ax 血清各蛋白组分的相对百分数-100 ATAx表示各球蛋白组分 （2A12）的吸光度。 2A A100 100 T T 1 1100 100 T T 2 2100 T 各组分蛋白百分数(%)血清总蛋白g/L各组分蛋白质含量

49、（g/L）- 100 9、临床意义（1）血清蛋白醋纤薄膜电泳的正常参考值为： 蛋白质组分 g/L 占总蛋白百分比(%) 白蛋白 3552 57.068.0 1球蛋白 1.04.0 1.05.7 2球蛋白 4.08.0 4.911.2 球蛋白 5.010.0 7.013.0球蛋白 6.013.0 9.818.2（2）临床意义电泳图谱可为临床疾病诊断提供依据。肾病型可见于急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭等，图型表现为Alb降低，2和升高；肝硬化型可见于慢性活动性肝炎、肝硬变等，图型表现为Alb降低，和增高，可出现与难以分离而连接在一起的“”桥，此现象是由于肝脏纤维增生导致IgA增高所致；急性反应

50、时相型常以1、2增高为特征；慢性炎症型则以Alb降低，2、增高较为常见；M蛋白血症主要见于多发性骨髓瘤，病人有大量单克隆蛋白质（主要是IgG或IgA），电泳时可在和之间出现一条峰形狭窄的区带，称M区带。【注意事项】1 通电时，不得接触槽内的缓冲液或CAM，以防触电。2 每次电泳时应交换电极以使两侧电泳槽内缓冲液的正负离子相互交换，以使缓冲液的PH维持在一定水平。 3电泳缓冲液的液面要保持一定的高度，过低可能会出现球蛋白的电渗现象（球蛋白向阴极移动），同时电泳槽两侧的液面应保持在同一水平，否则，通过薄膜时有虹吸现象，将会影响蛋白质分子的泳动速度。 4电泳失败或图谱不理想的常见原因 （1）电泳图谱

51、不整齐或蛋白各组分分不佳：点样过多；点样不均匀、不整齐；薄膜过湿，样品扩散；点样速度太慢，薄膜表面局部干燥或薄膜未完全浸透或温度过高致使膜面局部干燥或水分蒸发；缓冲液变质；电泳时薄膜放置不正，歪斜、弯曲，与电流方向不平行；样品不新鲜；电流过低；CAM质量不好，薄膜结构过分细密，透水性差，导电差等。（2）染色后白蛋白中间着色浅：染色时间不够或染色液陈旧；白蛋白含量过高，可减少血清用量或延长染色时间。 （3）电泳速度慢：电流过低；供给薄膜的缓冲液不足，连接薄膜与缓冲液的滤纸或纱布过薄；温度过低；薄膜结构过分细密，透水性差，导电差；缓冲液水分蒸发，致使离子强度增大。（4）薄膜透明不完全：透明液陈旧；

52、浸泡时间不足；烘箱温度未到90即把薄膜放入。 5染料问题：各种染料对血清各组分有不同的亲和力，大多数染料对白蛋白的亲和力大于球蛋白。如氨基黑10B对球蛋白的结合力为白蛋白的80，因此常导致白蛋白结果偏高，球蛋白偏低。用丽春红S染色，效果优于氨基黑10B。丽红是一种指示剂，PH10时呈红色，PH12.5时呈紫色。在酸性溶液中它的最大吸收峰在523nm左右，呈对称性。在血清蛋白正常浓度范围内，丽春红S能与各蛋白质组分成正比例结合，而氨基黑10B则对白蛋白染色过深，区带中容易出现着色不全的小点，不够理想。6样品要求点在粗糙面（无光泽面），否则样品很难吸入膜内。电泳时最好将点有样品的一面朝下，以防电泳

53、过程中水分蒸发，影响电泳结果。7标本应新鲜，不得溶血。溶血标本会使球蛋白假性升高，因血红蛋白电泳位置在球蛋白区域内。思考题 1血清蛋白在醋酸纤维薄膜上可分成5条区带，每条区带是否分别只代表一种蛋白质? 2用什么方法可证明醋酸纤维薄膜有无电渗作用? 3电场强度愈高血清蛋白在醋酸纤维薄膜上的泳动率愈高，是否电场愈高愈好?附注： 电 泳 技 术带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象称为电泳(Electrophoresis)，电泳技术是生物化学与分于生物学中的重要研究方法之一。利用电泳技术可分离许多生物物质，包括氨基酸、多肽、蛋白质、脂类、核苷、核苷酸及核酸等，并可用于分析物质的纯度和分子量的测定等。电泳按介质状想来分，有自由电泳和区带电泳两大类。前者以溶液为介质，在溶液中将蛋白质分离开来。两者相比较，自由电泳过程中扩散严重，分辨率有限，而且设备昂贵，操作繁琐，现在已基本上被区带电泳法所取代。所谓区带电泳法，就是在固体支持物上所进行的电泳。50年代以来，常用的固体支持物有滤纸、醋酸纤维薄膜、淀粉凝胶、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等等。区带电泳法分辨率很高，而且设备简单，操作方便，已经是生物化学及分子生物学领域中极为有用的技术。 一、电泳法的