常用分子生物学技术的原理及其应用

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1、常用分子生物学技术的常用分子生物学技术的原理及应用原理及应用The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology第二十章第二十章第一节第一节分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Techniquen核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)在在DNA复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同DNA单链单链分子放在同一溶液中，或把分子放在同一溶液中，或把DNA与与RNA放在一放在一起，只

2、要在起，只要在DNA或或RNA的单链分子之间有一定的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链成杂化双链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理复性复性RNADNA（一）印迹技术（一）印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为此称之为“blotting”，译为印迹技术。，译

3、为印迹技术。用放射性核素、生物素或荧光染料标记其用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针探针”，探针可以与固定在，探针可以与固定在NC膜上的核苷膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。（二）探针技术（二）探针技术二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹印迹(Southern blotting)（二）（二）RNA印迹印迹(Northern blotting)（三）蛋白质的印迹（三）蛋白质的印迹(Western blotting)用于基因组用

4、于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。n其他：其他：斑点印迹斑点印迹(dot blotting)原位杂交原位杂交(in situ hybridization)DNA点阵点阵(DNA array)DNA芯片技术芯片技术(DNA chip)三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较分子杂交实验分子杂交实验放放射射自自显显影影照照片片DNA芯片芯片技术技术第二节第二节PCR技术的原理与应用技术的原理与应用The Principle and Application o

5、f PCR Technology5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA一、一、PCR技术的工作原理技术的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。PCR技术原理示意图技术原理示意图 n PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C 模板模板DNA 特异性引物特异性引物 耐热耐热DNA聚合酶聚合酶 dNTP

6、s Mg2+n PCR体系基本组成成分体系基本组成成分利用特异性引物以利用特异性引物以cDNA或基因组或基因组DNA为模板获为模板获得已知目的基因片段得已知目的基因片段,或与逆转录反应相结合，直或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；为模板获得目的片段；利用简并引物从利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；序列相似的基因片段；利用随机引物从利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆文库或基因组文库中克隆基因。基因。二、二、PCR技术技术的主要用途的主要用途（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆利用利用

7、PCR技术可以随意设计引物在体技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。变等改造。PCR技术高度敏感，对模板技术高度敏感，对模板DNA的的量要求很低，是量要求很低，是DNA和和RNA微量分析的微量分析的最好方法。最好方法。（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（二）基因突变（二）基因突变将将PCR技术引入技术引入DNA序列测定，使测序序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；工作大为简化，也提高了测序的速度；待测待测DNA片段既可克隆到特定的载体后片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。进行序列测定

8、，也可直接测定。PCR与其他技术的结合可以大大提高基与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性因突变检测的敏感性。（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析 逆转录逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将是将RNA的逆转录反应和的逆转录反应和PCR反应联合反应联合应用的一种技术。应用的一种技术。RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分进行定性及半定量分析的最有效方法。析的最有效方法。（一）逆转录（一）逆转录PCR技术技术三、几

9、种重要的三、几种重要的PCR衍生技术衍生技术 原位原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或或RNA是否在该组织或细胞中存在。是否在该组织或细胞中存在。原位原位PCR方法弥补了方法弥补了PCR技术和原位杂交技术技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。一种最佳方法。（二）原位（二）原位PCR技术技术（三）实时（三）实时PCR技术技术实时实时

10、PCR(real-time PCR)技术通过动态技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。n实时实时PCR技术原理技术原理QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物荧光标记引物荧光标记引物RQ 3355n实时实时PCRPCR分类：分类：实时实时PRC非探针类非探针类探针类探针类1.TaqMan1.TaqMan探针法探针法 2.2.分子信标探针法分子信标探针法 3.FRET3.FRET探针法探针法 图20-3 TaqMan探针法实时PCR原理示意图第三节第三节基因文库基因文库Gen

11、e Library 基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)cDNA文库文库(cDNA library)n基因文库基因文库(gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列序列的克隆群体。的克隆群体。一、基因组一、基因组DNA文库文库基因组基因组DNADNA文库是指生物的文库是指生物的基因组基因组DNA的的信息（包括所有的编码区和非编码区）以信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。片段形式贮存的克隆群体。用于构建基因组文库的载体有用于构建基因组文库的载体有 噬菌体、噬菌体、粘粒和酵母人工染色

12、体等。粘粒和酵母人工染色体等。n基因组文库和基因组文库和cDNA文库的构建和筛选文库的构建和筛选第一轮筛选第一轮筛选第二轮筛选第二轮筛选第三轮筛选第三轮筛选n基因组文库筛选结果举例基因组文库筛选结果举例cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部件下所表达的全部mRNAmRNA经逆转录而合成的经逆转录而合成的cDNA序列序列的克隆群体，它以的克隆群体，它以cDNA片段的形片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。式贮存着该组织细胞的基因表达信息。二、二、cDNA文库文库第四节第四节生物芯片技术生物芯片技术Biological Chip Technique

13、是指将许多特定的是指将许多特定的DNADNA片段有规律地紧密排片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列微阵列(DNA microarray)。一、基因芯片一、基因芯片n基因芯片基因芯片(gene chip)n基

14、因芯片工作流程示意图基因芯片工作流程示意图是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片蛋白质分子间的亲和反应蛋白质分子间的亲和反应n蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)n蛋白质芯片蛋白质芯片作用原理作用原理第五节第五节生物大分子相互作用研究技术生物大分子相互作用研究技术 The Method o

15、f Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study一、蛋白质相互作用研究技术一、蛋白质相互作用研究技术 酵母双杂交酵母双杂交 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选噬菌体显示系统筛选n常用蛋白质相互作用的研究技术常用蛋白质相互作用的研究技术标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀（一）标签蛋白沉

16、淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。合的未知分子。标签融合标签融合蛋白沉淀蛋白沉淀实验流程实验流程示意图示意图（二）酵母双杂交技术的基本原理（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途和用途n酵母双杂交系统的应用酵母双杂交系统的应用 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。的生物信息学推测。分析已知存在相互作用的两种蛋白质分

17、子的的分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。将拟研究的蛋白质的编码基因与将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成基因融合成为为“诱饵诱饵”表达质粒，可以筛选表达质粒，可以筛选AD基因融合的基因融合的“猎物猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。蛋白质。电泳迁移率变动测定电泳迁移率变动测定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验或称凝胶迁移变动实验(gel shift assay)最初用于研究最初用于研究DNA结合

18、蛋白与相应结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究术也被用于研究RNA结合蛋白和特定结合蛋白和特定RNA序列间序列间的相互作用。的相互作用。二、二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定（一）电泳迁移率变动测定放放射射自自显显影影未结合探针未结合探针结合有蛋白的探针结合有蛋白的探针标记探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X未标记探针未标记探针10Xn凝胶迁移实验结果示意图凝胶迁移实验结果示意图染色质免疫沉淀技术染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是目前可是目前可以研究体内以研究体内DNA与蛋白质相互作用的与蛋白质相互作用的主要方法。主要方法。（二）染色质免疫沉淀法（二）染色质免疫沉淀法n染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图