搅拌式生物反应器换液培养脐血造血细胞的研究

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1、搅拌式生物反响器换液造就脐血造血细胞的研究迟占据，姜华，谭文松，戴干策，赵春华【摘要】为进一步进步脐血造血细胞的扩增倍数并到达临床范围，本研究中利用自主开拓的有溶氧和pH操纵的搅拌式生物反响器举行了脐血造血细胞的换液造就。结果表白，造就中总细胞、D34+细胞、各系集落形成细胞(FU-G，BFU-E，FU-ix，FU-k)的扩增倍数均高于方瓶造就，并且由于操纵了较低的溶氧，所造就细胞中干/祖细胞含量明显高于方瓶造就。该反响器中造就的脐血造血细胞到达了临床应用的范围。结论：反响器中造就环境更有利于干/祖细胞的维持和扩增，并且可到达成人造血干细胞移植所需细胞量。【关键词】脐血Exvivulturef

2、UbilialrdBldHeatpietiellsinStirredTankBireatrithfeedingprtlAbstratTinreasetheexpansinultiplefrdbld(B)heatpietiellsandtreahasalefrlinialappliatin，thennulearellsfrBereulturedinaautnuslydevelpedstirredtankbireatrithdisslvedxygen(D)andpHntrlling.Theresultshedthattheexpansinultiplefttalells，D34+ells，andp

3、rgenitrsells(FU-G，BFU-E，FU-ix，andFU-k)inbireatreregreaterthanthatinT-flasks.TheratefprgenitrstttalellsinbireatrultureasalsgreaterthanthatinT-flasks.Thegdresultsinbireatrshuldbeattributedtthentrlled，ptiizedD.linial-saleultureasrealizedfrnesaplefBinthisbireatr.Theseresultssuggestedthattheultureenvirne

4、ntinbireatrithptialDandpHntrllingisrefavrablefrste/prgenitrellaintenaneandexpansin，andtheexpandedellsfrnesaplefBisenughttransplantfranadultpatient.Keyrdsrdbld；heatpietiell；bireatr；stirredulture脐血细胞中富含造血干细胞，从而成为除骨髓和外周血之外一个紧张造血干细胞泉源，在临床上有着普及应用，但脐血中造血干细胞的绝对数目少，无法满意成人的移植要求，而通过体外造就和扩增有望降服这一抵牾。体外扩增骨髓细胞、外周

5、血细胞、脐血细胞的临床实行都已有所报道1，2，证实白体外扩增后细胞用于临床的宁静性和可行性。如今开拓的体外扩增造血干细胞的造就体系重要有平板灌注腔反响器、结实床和流化床反响器、搅拌式反响器等3。此中搅拌式生物反响器能提供均一的造就环境，并且取样和数据网罗简朴，易于实现主动操纵，因此，在造血细胞临床范围造就中有较好的应用远景3，4。本研究应用自主开拓的搅拌式生物反响器体系，举行脐血造血细胞的换液造就研究。质料和要领脐血(B)和单个核细胞(N)的分散脐血由上海国际宁静妇婴保健院提供。供者要求是身材康健、发育精良的非高龄产妇。脐血经淋巴细胞分散液(Fill)密度梯度离心后，网络单个核细胞，并以ID造

6、就液洗涤2次。造就基和细胞因子体外造就液用IDGib公司，利用时添加20胎牛血清(FBS)，以及SF50ng/l、IL-35ng/l、IL-620ng/l、G-SF2.0ng/l和G-SF2.0ng/l，此中SF、IL-6购于北京宝赛生物技能公司，IL-3购于Pepr-Teh公司，G-SF购于上海三维制药厂，G-SF购于上海海济生物技能。造血细胞的反响器换液造就将分散得到的脐血单个核细胞以2106ells/l的密度在T-175方瓶中造就4天后，再接种到反响器中或T-25型方瓶Nun公司中举行造就，举行的2次实行中接种密度均为0.8106ells/l。反响器为自主开拓产物，此中反响器中所用质料颠

7、末造血细胞的生物相容性查验，反响器事情体积为300-500l，搅拌体系为磁力搅拌，转速操纵为30r/in。反响器的温度操纵为37，溶氧和pH通过调治气氛、氮气、氧气和二氧化碳的流量来操纵，通气方法为外貌通气。pH操纵在7.15，溶氧操纵为饱和溶解气氛的25。细胞接种到反响器后，待细胞密度生长至2.0106ells/l后举行换液，即取出50的细胞液，并参加雷同体积含有雷同细胞因子的奇怪造就液。实行中以T-25方瓶作比拟，每瓶装液7l，置于37、52、饱和湿度的造就箱中举行细胞造就，方瓶与反响器中换液比例和频率雷同。细胞计数及活性阐发台盼蓝染色后利用血球计数器举行活细胞和总细胞的计数，由于实行中很

8、少能见到被染成蓝色的细胞死细胞，因此，未进一步盘算细胞活性。造血细胞的集落检测集落的检测体系为ID造就液，添加20胎牛血清FBS，4l/l谷氨酰胺Siga，含0.9甲基纤维素(4000p，Siga)，以及人重组造血生长因子SF、IL-3、IL-6、G-SF、G-SF、EP，其浓度别离为50、20、20、20、20ng/l和2U/l，并添加1牛血明净卵白BSA。取(1-3)104造就或没造就的单个核细胞参加0.5l集落造就液中，置于37、52、饱和湿度的二氧化碳造就箱中造就12天后，举行FU-G、BFU-E、FU-ix计数，此中FU-ix为至少含有粒细胞和红细胞的集落。FU-k的检测接纳血浆块法

9、，细胞以1105ells/l的接种密度接种于24孔板中，每孔加50l脐血浆，50l3.4g/L的al2溶液，另参加含有TP20ng/l、IL-310ng/l、IL-610ng/l的造就基Gib公司，混匀后静置凝固。造就10-12天后，用13的甲醇/丙酮溶液原位脱水，并结实30分钟，然后按序次参加1%BSA、鼠抗人D41抗体、生物素标识表记标帜的羊抗鼠IgG抗体、抗生物素卵白-碱性磷酸酯酶复合物参加后都要作用一按时间，然后用0.05l/Ltris/Nal缓冲液淋洗3遍，再参加别的试剂，染色后在40目镜下不雅测呈赤色的集落。细胞表型阐发流式细胞仪阐发中所用抗体为Pharingen公司产物。取1.0

10、106未扩增或扩增后的细胞参加1.5l离心管中，用PBS洗2遍，离心后倒掉上清液，加PE偶联的小鼠抗人D34单克隆抗体和FIT偶联的小鼠抗人D45单克隆抗体各10l，4孵育30分钟。PBS洗2遍，离心后，每管加1lFAS保存液；标识表记标帜抗体后的细胞用流式细胞仪BetnDikinsn公司阐发，结果用LysisII软件处置惩罚。结果总细胞的扩增干/祖细胞的扩增BFU-E到达最大扩增倍数的时间较早，在7天摆布，由于本实行中没有添加EP，以是BFU-E的扩增倍数不高，由图2可以看出，反响器中扩增倍数不停高于方瓶。造就中D34+细胞的扩增如图3所示，反响器扩增倍数不停上升，至14天时到达最大，方瓶造

11、就到第7天时与反响器相差不大，第10天开始有较大差异，第14天的扩增倍数比第10天时进步不大。由图瞥见终极反响器中D34+细胞的扩增倍数高于方瓶造就。反响器造就的范围附表表现了2次实行中反响器造就的范围，由附表可见，假设不取出细胞而接纳流加方法造就细胞，那么造就到12天时，第1次实行中可得到2.44109总细胞、4.88106FU-ix、11.9106FU-G和59.5106D34+细胞，第2次实行可得到2.03109总细胞、3.53106FU-ix、9.0106FU-G、和36.7106D34+细胞。造血干细胞移植中细胞必要到达的抱负量是总细胞3.7107ells/kg，和FU-G2.010

12、5ells/kg，D34+细胞2.5106ells/kg。按此盘算，对付1个50公斤体重的病人总细胞、FU-G、D34+细胞必需别离到达1.85109、10106、和125106个。我们的检测中是作同一集落阐发而别离计数FU-G和FU-ix，而FU-ix是比FU-G更原始的细胞，因此，这两个数字应该相加再与文献中所述的FU-G量比拟才是科学的，从总细胞和集落形成细胞数来说，反响器造就所得细胞可到达抱负量的要求。D34+细胞数固然小于抱负量，但也可满意最低量25106细胞的要求。因此，假设利用该反响器不停补料造就，可以从一份脐血造就得到充足用于临床的细胞量。讨论造血干/祖细胞移植如今在临床中重要

13、用于造血干/祖细胞缺陷性血液并先本性免疫并各种自身免疫并及实体瘤的治疗，是一种紧张的细胞治疗本领。脐血造血干/祖细胞作为一种造血干/祖细胞泉源，由于数目较少，在临床上只能用于儿童患者，要应用于成人患者那么必需通过体外扩增增长其数目，此中造就环境中的溶氧、pH、细胞因子、造就方法等对扩增结果有紧张影响。因此，要实现造血干细胞体外扩增技能在临床上应用，必要开拓出充足大范围、尺度化的造就体系以及相应的扩增工艺。本研究接纳搅拌式生物反响器在临床范围扩增了脐血单个核细胞，扩增得到的细胞中代表造血干/祖细胞的D34+细胞、FU-G、FU-k等细胞的含量均较通例的静态造就高，更适于临床应用。并且，其造就范围

14、到达了临床应用中所需移植细胞量的要求。溶氧是造血细胞发育的紧张调控因子，许多报道都表白，低氧分压1-5比正常氧分压20有利于造血干/祖细胞的维持和扩增6，因此，我们在生物反响器中操纵的溶氧为饱和气氛的25%，这与5氧分压相称。实行表白，反响器造就中不单细胞扩增倍数高，所得细胞中FU-G、FU-ix、FU-k，D34+细胞的含量都高于方瓶造就的结果，并且维持时间比方瓶中长，这应该与反响器中所维持的低溶氧有关。值得留意的是，在本体系中固然在必然程度上可以减缓造血干/祖细胞的分化速率，但并不克不及从底子上办理造就历程中造血干/祖细胞的分化题目。别的，本实行中所检测的各种集落形成细胞及D34+细胞都仅

15、能代表造血祖细胞，因此其扩增环境只能代表祖细胞的扩增，假设要确定造血干细胞是否真正实现了扩增，那么必要举行SID小鼠体内造血重修实行才气够确定。llins等3也用400l的有pH和溶氧操纵的反响器举行了脐血造血细胞的造就，其2次实行中总细胞别离扩增了约35倍和200倍，而FU-G别离扩增了约23倍和30倍，我们的结果与之比拟相差不大。Ki等7在不操纵pH和溶氧的转瓶中举行了骨髓造血细胞的造就，造就中只添加细胞因子组合IL-3、SF、G-SF和EP，结果总细胞和FU-G只扩增了8倍和5倍。在此底子上添加基质细胞条件造就基明显进步了总细胞的扩增，FU-G扩增也进步到了17倍，FU-G含量大大增长。

16、我们的实行中所添加的细胞因子为IL-3、IL-6、SF、G-SF和G-SF，此中促分化的IL-3、G-SF和G-SF添加量都较小，别离为5ng/l、2ng/l、2ng/l，这对防范细胞过早分化有必然作用。假设在此底子上进一步优化造就基，如添加基质细胞条件造就基或FL和TP等能促进干细胞增殖的细胞因子等，有望进一步进步造血干/祖细胞的增殖。除造血干/祖细胞外，为收缩粒细胞和血小板的规复期，以及为放疗和化疗提供帮助治疗，临床中对粒细胞、巨核细胞、红细胞等成熟细胞的需求也很大，因此，造就成熟细胞也是造血细胞体外扩增的紧张内容之一。NEildez-Nguyen等8在体外造就红细胞前体细胞的实行中所造就的总细胞数达1010个，这些前体细胞在输入小鼠体内后可分化为成熟的红细胞，对付云云大范围的成熟细胞造就，应用搅拌式生物反响器将更有上风。