S100A16在饮食诱导肥胖大鼠中的作用研究

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1、S100A16在饮食诱导肥胖大鼠中的作用研究 摘要 目的：探讨S100A16蛋白对体重增加过程的影响，进一步研究S100A16蛋白在肥胖及肥胖相关疾病的发生发展过程中的作用。方法：正常8周龄大鼠随机分为正常饮食组（NF, n=10）和高脂饮食组(HF, n=10)，建立饮食诱导的肥胖（DIO）大鼠模型，喂食14周时进行腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）及胰岛素释放试验（IRT）,喂食16周处死后称量皮下及内脏脂肪重量，采用HE染色方法 (hematoxylin and eosin staining, HE) 观察肝脏脂肪变性程度，放射免疫分析法检血糖，血清胰岛素，尿酸等血清生化指标，同时应用We

2、stern blotting 方法检测脂肪组织中 S100A16及糖脂代谢相关转录因子的蛋白表达。结果：DIO组大鼠的体重，内脏脂肪明显高于正常组，血清总胆固醇和尿酸DIO组高于正常组但糖耐量和胰岛素释放低于正常组，western blotting 显示DIO组大鼠脂肪和肝脏组织中S100A16，PPAR-, C/EBP-a的蛋白表达均高于正常组。结论：高脂饮食可上调S100A16及相关转录因子的表达；S100A16的高表达可促进脂质生成及肥胖发生，并对机体的胰岛素敏感性产生负性影响。关键词 胰岛素敏感性，肥胖，大鼠模型，S100A16，转录因子中图分类号R587.1 文献标识码 A The

3、role of S100A16 in rats with diet-induced obesityObjective: To investigate the effect of S100A16 on weight gain process, the development of obesity and obesity related diseases occur. Methods: Rats aged 8 weeks were randomly divided into normal diet group (NF, n = 10) and a high-fat diet group (HF,

4、n = 10), providing diet for 16 weeks to establish a diet induced obesity (DIO) rat model. When feeding at 14 weeks, rats were processed intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) and insulin release test (IRT). When rats were executed after 16 weeks, weighted subcutaneous and visceral fat weight

5、. Then we used HE staining method (hematoxylin and eosin staining, HE) to observe the liver steatosis degree, radiation immunity analysis to check blood sugar, insulin, serum uric acid, serum biochemical indicator, and Western blotting to study the expression of S100A16 and glucolipid metabolism rel

6、ated protein expression of transcription factors in liver and adipose tissue. Results: DIO group rats weight, visceral fat is significantly higher than normal group. The serum total cholesterol and uric acid in DIO group was higher than normal glucose tolerance and insulin release is lower than the

7、normal group. Western blotting showed that in liver and fat tissue of DIO group, S100A16, PPAR-, C/EPB-a expression were significantly higher than those of normal group. Conclusion: High fat diet can increase the expression of S100A16 and related expression of transcription factors; S100A16 over exp

8、ression can promote lipid generated and result in a negative impact on insulin release and insulin sensitivity. Key words: Insulin sensitivity; obese; rat model; S100A16; transcription factor.肥胖是由于食物摄入与能量消耗之间的不平衡导致脂肪组织增多，肥胖引起的高血脂、高血压等一系列并发症已经给个人，家庭及社会带来了沉重的负担1。目前临床上并没有治疗肥胖的有效手段，所以近年来从能量代谢途径寻找方法防治肥胖及

9、相关并发症已成为医学热点2。S100蛋白家族是EF手型（EF-hand）钙结合蛋白超家族中最大的亚群，参与细胞生长，细胞周期调节，转录及翻译等多种胞内活动3,4。由于它们的广泛表达于大多数肿瘤组织中，S100蛋白已被作为肿瘤的生物标记物5。S100蛋白表达的上调或下调在其他多种人类疾病（如胰岛素抵抗，血脂异常，高血压等）中起重要作用6。S100A16作为S100家族中的新成员，被发现于核仁内，在Ca2+ 的刺激下转移至胞内7。在我们的前期研究中发现S100A16蛋白表达增强可促进脂肪细胞分化，提示其与肥胖相关8。然而，关于S100A16在组织的特异性生理功能仍不是很清楚。为进一步探讨S100A

10、16基因在肥胖中的作用及其可能机制，我们建立了饮食诱导的肥胖大鼠模型，旨在揭示S100A16在肥胖中的作用，有望为肥胖的防治提供新的线索。1 材料和方法1.1 材料雄性（Sprague-Dawley）SD大鼠（江苏省试验动物中心，中国）；正常饮食购自江苏省实验动物中心（实验动物配合饲料GB14924.3-2001）,总热能3850Kcal,含蛋白质19.2%，碳水化合物67.3%，脂肪4.3%；高脂饮食购自Research Diets公司 (New Brunswick, NJ, USA)，总热能4730Kcal，含蛋白质24%，碳水化合物41%，脂肪24%；血糖检测仪及试纸（Bayer公司，德

11、国）；S100A16抗体（S100A16-Ab）根据文献有本实验室制备9。过氧化物酶体增生物激活受体-（PPAR-）抗体（Sigma公司，美国）；CCAAT/增强子结合蛋白-a（C/EPB-a）抗体（CST公司，美国）；羊抗兔IgG抗体（Santa Cruz公司，美国），其他常规试剂为国产分析试剂。1.2 方法1.2.1 建立大鼠DIO模型取20只雄性8周龄SD大鼠（25021g），随机分为实验组与对照组，分别给予16周高脂饮食（High-fat Diet, HFD）和正常饮食（Normal-fat Diet, NFD），每周称量体重，持续16周。喂食16周后，处死，心脏采血，取大鼠脂肪组织，

12、肝脏组织，标本分别做：相关代谢指标的测定；脂肪组织称重；Western blot检查；石蜡切片HE染色。1.2.2 脂肪组织称重SD大鼠喂食16周后晚间禁食10小时，麻醉后处死，分别取腹部脂肪及皮下脂肪，称取重量。1.2.3 糖脂代谢指标测定SD大鼠麻醉后，心脏穿刺取血，冰上静置15分钟后，以4C， 3500r/m离心20分钟后取上清，采用全自动生化分析仪（Olympus公司，日本）测定血糖（GLU），血清甘油三酯（TG），血清总胆固醇（TC），血清高密度脂蛋白（HDL），血清低密度脂蛋白（LDL），尿酸（UA）等糖脂代谢相关指标。1.2.4 IPGTT实验和IRT实验SD大鼠喂食14周后，大

13、鼠于夜间禁食10小时后眼眶内眦采静脉血测定基础血糖值和基础血清胰岛素水平，随后向大鼠腹腔注射葡萄糖溶液（50%，2g/kg），于15min，30min，60min，120min时取小鼠眼眶静脉血测定血糖值和血清胰岛素水平。1.2.5 HE染色观察肝脏组织形态学变化取实验组和对照组大鼠肝脏组织标本，制成石蜡切片。HE染色后显微镜下观察肝脏组织脂肪变性的病理改变。1.2.6 Western blot检查脂肪和肝脏组织中S100A16和糖脂代谢相关转录因子的蛋白表达取脂肪和肝脏组织，加入RIPA裂解液进行裂变，离心后取上清95C变性5分钟后进行SDS-PAGE电泳，后将蛋白转到PVDF膜上。封闭后放

14、进一抗中4C孵育过夜，TBST洗涤3次，室温下放进二抗中孵育1小时，洗涤后ECL发光显色，并使用ImageJ软件对电泳条带进行蛋白表达相对值分析。1.3 统计学方法所得数据均以均数标准差(士S)表示，应用Excel 2007统计软件，采用单因素方差分析，P0.05是为差异有统计学意义。二、结果2.1 高脂饮食对SD大鼠体重及内脏脂肪重量的影响称量两组SD大鼠的原始体重后分别开始喂食高脂饮食和普通饮食，每周称量以观察体重变化。实验组(HFD)大鼠体重增长明显超过对照组(NFD)大鼠(图1A)。处死大鼠后，取内脏脂肪，称取其重量。实验组大鼠内脏脂肪重量同样明显大于对照组(图1B)。2.2 高脂饮食

15、对糖脂代谢相关生化指标的影响实验组大鼠TG和UA明显高于对照组差异有统计学意义(P0.05)；而TC，GLU和HDL各组无显著差异(P0.05) (表1)。2.3 饮食诱导的肥胖对糖耐量及胰岛素敏感性的影响IPGTT实验和IRT实验的结果分析提示腹腔注射高浓度葡萄糖溶液后，两组大鼠的血糖值均在15-30分钟后达到血糖高峰。但是，实验组大鼠的血糖高峰值明显高于对照组(P0.05) (图2A)。实验组大鼠的血清胰岛素释放水平在血糖高峰时也明显高于对照组(P0.05) (图2B)。2.4 DIO大鼠肝脏组织的病理学改变，S100A16及糖脂代谢相关因子的蛋白表达2.4.1 通过对比两组大鼠的HE染色

16、切片后可以看出，实验组大鼠肝脏组织的空泡数明显多于对照组，说明实验组大鼠的肝脏脂肪变性的程度大于对照组(图3A)。2.4.2 为了检测肝脏组织中S100A16及糖脂代谢相关转录因子的蛋白表达情况，取肝脏组织进行western blot检查，结果发现，实验组大鼠肝脏组织S100A16蛋白表达高于对照组。PPAR-和C/EPB-a在肝脏中的表达量同样实验组高于对照组(图3B)。 2.5 DIO大鼠脂肪组织中S100A16及糖脂代谢相关因子的蛋白表达情况取脂肪组织检测脂肪组织中S100A16蛋白的表达情况，结果显示，实验组大鼠脂肪组织中S100A16蛋白的表达量较对照组有明显增高。糖脂代谢相关的重要

17、转录因子：PPAR-，C/EBP-a在脂肪组织中的表达情况，与S100A16蛋白的表达趋势一致。(图4)三、讨论肥胖是由于食物摄入与能量消耗之间的不平衡导致脂肪组织增多，据统计全球的肥胖人口已超过3亿，伴随肥胖带来的一系列相关疾病，如2型糖尿病，高血压，高血脂，冠心病等，不仅严重影响人们的生活质量，也造成了巨大的社会负担。近年来从能量代谢途径寻找防治肥胖相关并发症的有效手段成为医学热点2。钙结合蛋白S100家族在细胞迁移，分化，增生与凋亡及肿瘤发生发展中都发挥重要作用10。S100A16作为家族中的新成员，在人体各组中器官中广泛表达5。本课题组早先的研究表明S100A16蛋白的表达量随着小鼠前

18、体脂肪细胞3T3-L1的分化过程而增加，并且高表达3T3-L1细胞中的S100A16蛋白，可明显地促进脂质生成和胰岛素刺激下的葡糖糖摄取，从而引起胰岛素抵抗8。本研究中，实验组大鼠的体重数据，内脏脂肪重量及血清生化指标检测结果（图1、表1）表明DIO大鼠模型造模成功。IPGTT结果显示DIO大鼠较正常大鼠血糖高峰后延且胰岛素水平降低，说明实验组大鼠已发生胰岛素抵抗(图2)。 Gaggini M11的研究认为，肝脏的非酒精性脂肪变性(NAFLD)可导致胰岛素抵抗，并且两者共同作用可引起代谢疾病及心血管疾病的发生发展。Liu Y8的研究提出，S100A16蛋白可促使3T3-L1细胞的胰岛素敏感性下

19、降。本实验中实验组大鼠肝脏较对照组已发生明显NAFLD(图3A)，并且实验组大鼠的肝脏组织中S100A16蛋白的表达量明显高于对照组(图3B)，提示S1001A16与肝脏非酒精性脂肪变性和胰岛素敏感性降低有密切关系。研究证实，脂质生成要经历细胞增殖和脂肪细胞分化两个过程12，有多种转录因子在脂肪细胞的分化过程中发挥重要作用，其中PPAR-和C/EBP-a的作用最为显著12。PPAR-和C/EBP-a可调控细胞由增殖生长向脂肪细胞分化的转变并可作为胰岛素抵抗的标志基因13,14。本课题组前期的体外实验中发现，高浓度钙可使钙结合蛋白S100A16由核内向胞质内转移，通过激活S100A16介导的钙离

20、子信号通路促进3T3-L1细胞的脂质生成和葡萄糖的摄取，但其具体分子机制尚不清楚7。有相关文献报道，钙离子信号通路不仅可通过PPAR-和C/EBP-a促进脂肪细胞分化15,16，还参与对PPAR-内源性配体生成的调控，调节胰岛素敏感性 17。本实验中，实验组大鼠大鼠的肝脏和脂肪组织中PPAR-和C/EBP-a的表达量均高于对照组，与S100A16在肝脏和脂肪组织中的表达一致(图4)。结果说明，钙离子结合蛋白S100A16参与调节脂肪细胞分化，从而参与脂质形成和胰岛素抵抗。综上所述，本研究的结果提示，钙离子结合蛋白S100A16与肥胖是密切相关的，它对脂肪细胞的分化起到重要作用，是一种脂质生成的

21、促进因子，并且对胰岛素敏感性产生不良影响。当然，S100A16蛋白作用于肥胖的具体分子机制仍有待进一步研究。参考文献：1.Paterson JM, Morton NM, Fievet C, et al. Metabolic syndrome without obesity: Hepatic overexpression of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 in transgenic miceJ. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004,101(18):7088-7093.2.Herr CE, Zur Nieden A

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31、al adipocyte lipid accretion表1 高脂饮食对糖脂代谢相关生化指标的影响Effect of HF diet on glycolipid metabolism related biochemical indicatorsABA:大鼠IPGTT结果；B：大鼠IRT结果，*P0.05(n=10)图2 饮食诱导的肥胖对糖耐量及胰岛素敏感性的影响Effect of DIO on IPGTT and IRTA:大鼠肝脏组织HE染色切片；B：大鼠肝脏组织中S100A16及糖脂代谢相关蛋白的表达图3 DIO大鼠肝脏组织的病理学改变，S100A16及糖脂代谢相关因子的蛋白表达HF diet increased adipogenesis in liverA: Western blot检测蛋白表达情况；B:蛋白表达的相对灰度值，*P0.05(n=10)图4 DIO大鼠脂肪组织中S100A16及糖脂代谢相关因子的蛋白表达情况Eexpression of S100A16 ,PPAR- and C/EPB-a in adipose tissue of DIO