基因操作技术1

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1、1. 载体的定义？载体：指携带外源基因进入受体细胞的运载工具，它的本质是DNA复制子。2. 载体必须具备的3个基本条件?载体的碱基对越多越好？（1）基本条件：1具有复制子，能在宿主细胞内自主复制，并携带重组DNA分子一同 扩增；（2）2 具有单一限制性内切酶的酶切位点或多克隆位点；（3）3有合适的选择标记基因，用来筛选重组DNA。3. 载体的碱基对越少越好，否则容易错配.4. 目前研究最深，使用最多的载体有？目前研究最深、使用最多的载体是经过改造的质粒载体和噬菌体载体。5. 按功能分，有哪些载体？克隆载体的概念？表达载体的概念？（ 1）按功能分，可分为克隆载体、表达载体、测序载体、转化载体、穿

2、梭载体、多功能 载体等。（2）克隆载体：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质的 产物。（3）表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、PBS、终止 子），使目的基因能够表达的载体。6选择标记有哪些？插入失活、a-互补是什么意思？（1）选择标记有插入失活和a-互补（2）插入失活:若把外源DNA片段插入到载体的选 择标记基因中而使基因失活，丧失其原有的表性特征（3）a-互补：单独存在的a及w片段 均无B半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段时，宿主细胞内才有B 半乳糖苷酶活性，使特异性作用物变为蓝色化合物。7列举常用的质粒载体名称？PBR322

3、质粒、PUC载体、TA克隆载体8噬菌体的溶原状态是指？噬菌体感染大肠杆菌时，可能进入一个溶菌循环，结果导致细胞的裂解，释放出噬菌体 颗 粒；或者进入与宿主不同程度的稳定状态。9噬菌体DNA由哪三个部分组成？目的基因插入哪个部分？（1）噬菌体DNA由左臂、中臂、右臂三部分组成。（2）目的基因插入中臂（非必须区） 部分。10超级载体的特点？有哪些超级载体？1）超级载体的特点：运载量大（2）超级载体： YACs、 BACs11表达载体与克隆载体有什么最大的区别？表达载体有强大的启动子和SD序列，而克隆载体没有12限制性内切酶限制性内切酶：能识别DNA分子上的特定位点并将双链DNA切断的酶13. DN

4、A连接酶，T4连接酶DNA连接酶：一种能够在两条DNA链之间催化5 -P和3 -OH形成磷酸二酯键的酶T 4 连接酶：连接黏性末端或平末端的酶14. DNA聚合酶，Taq聚合酶DNA聚合酶：催化脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）聚合成DNA的酶Taq聚合酶：从嗜热水生菌中分离纯化出来的15逆转录酶逆转录酶：又称依赖于RNA的DNA聚合酶，是分子生物学中最重要的核酸酶之一。16.核酸酶，DNase,Rnase核酸酶：通过切割相邻两个核糖酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子发生水解断裂的蛋白酶DNase:即脱氧核糖核酸酶，特异水解断裂DNA分子的酶RNase:即核糖核酸酶，专门水解断裂RNA分子

5、的酶17. 碱性磷酸酶，细菌性/小牛肠碱性磷酸酶 碱性磷酸酶：有两种不同来源的碱性磷酸酶：一种是从大肠杆菌中纯化出来的，叫做细菌碱性磷酸酶；一种是从小牛肠中纯化出来的，叫做小牛肠碱性磷酸酶。它们能催化核酸分 子脱掉5磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5 -P末端转换成5 -OH末端。细菌碱性磷酸酶：一种是从大肠杆菌中纯化出来的，叫做细菌碱性磷酸酶 小牛肠碱性磷酸酶：一种是从小牛肠中纯化出来的，叫做小牛肠碱性磷酸酶18. DNA 与基因的区别？基因是有遗传功能的 DNA 片段19DNA的链是通过什么方式连接的？两条DNA单链是通过什么键连接在一起的？ （1）磷酸二酯键；（2）氢键20DNA 中

6、四种碱基对的名称？A （腺嘌吟）、G （鸟嘌吟）、C （胞嘧啶）、T（胸腺嘧啶）21DNA和RNA的区别？（D DNA是脱氧核糖核酸；RNA是核糖核酸；（2）这两种核糖的区别在于脱氧核糖2 -碳原子上的羟基被脱了氧，只剩下H,这个区别使得DNA比RNA更具有化学稳定性 22遗传信息是如何表达（翻译、传递）的？P1823mRNA,tRNA,rRNA 的功能分别是什么？mRNA 功能：信使tRNA 功能：转运rRNA 功能：存储24基因突变有哪几种类型？染色体畸变（1.染色体结构变异 2.染色体数目变异），点突变基因突变（错义突变、同义突变、无义突变） 25操纵子的概念？概念：在细菌中，一组基因受

7、一个启动子控制，被转录成一个长的RNA分子，这样的 一组基因成为操纵子。26简述乳糖操纵子的作用机理？P47 没有乳糖存在时,操纵子与启动子重叠,不能与启动子结合,结构基因无法表达,有葡萄糖 没有乳糖时,启动子与葡萄糖结合,27增强子的概念？沉默子的概念？增强子的概念：能强化转录起始的一段DNA序列为增强子或强化子 沉默子的概念：也称为沉默子元件，能够同反式因子结合从而阻断增强子及反式激活 因子的作用，并最终抑制该基因的转录活性。28真核生物，原核生物，病毒的基因组特点？真核生物基因组的特点： 1 基因组通常比较大2）含有内含子序列3）有大量重复序列 4）表达调控较复杂原核生物基因组的特定：

8、1）染色体不与组蛋白结合 2）不同生活习性下原核生物基因组 大小与GC含量有关病毒基因组的特点： 1 ）种类单一2 ）单倍数基因组，每个基因在病毒中只出现一次3 ） 形式多样4）大小不一 5）基因重叠6）动物、细菌病毒与真核、原核基因相似，内含子7） 具有不规则的结构基因8）基因编码区无间隔，通过宿主及病毒本身酶切9）无帽状结构 10） 结构基因没有翻译起始序列29. 基因操作基本步骤？1. 用 PCR 或人工合成的方法扩增目的基因。扩2. 用限制性内切酶将目的基因与载体切开。切3. 将目的基因与运载体结合。接4. 将重组 DNA 引入受体细胞。转5. 培养转化细胞，使其大量扩增。增6. 筛选

9、含有重组DNA分子的受体细胞。检30. 目的 基因分离有哪些方法？分别有什么样的特点？分离方法：1）鸟枪法 2）反转录法 3）人工合成法特点 1）鸟枪法：操作简单，广泛使用，工作量大，盲目有时并非一个基因2）反转录法：专一性强，操作过程麻烦，mRNA很不稳定要求的技术条件高3）人工合成法：专一性强，仅限于合成核苷酸对较少的简单基因31. PCR技术的目的是什么？操作的步骤和各步骤中发生的反应分别是什么？PCR 技术的目的是：通过重复循环变性、退火、延伸三个基本反应将所需目的基因在 体外成千上百万倍的扩增。操作步骤：循环变性退火延伸反应：循环变形：通过加热使模版 DNA 完全变性成为单链同时引物

10、自身和引物之间存在 的局部双链也得以消除退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模版DNA退火结合延伸：将温度升高，热稳定后DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成新的DNA链32. 基因操作的理想载体是什么？理想载体：质粒、噬菌体、柯斯质粒33DNA/RNA提取过程中有哪些注意事项？DNA提取注意事项：1）DNA样品不纯2）DNA降解3）DNA提取量RNA提取注意事项：1）RNA样品不纯2）RNA得率低3）RNA容易降解P80/P8434什么原因导致其不纯？对策？35什么原因导致得率低？对策？P80 8436什么原因导致降解？对策？37简述常见的核酸检测方法？1）紫外光谱分析法2）荧光分光光度法3）

11、凝胶电泳法P8538纯 DNA 的 00260/280?纯 RNA 的 00260/280?纯 DNA 的 OD260/OD280 应大于 1.8纯 RNA 的 OD260/OD280 应达到 2.039荧光分光光度法的特点？ 灵敏度高2）信息多3）专一性强4.工作曲线的线性范围宽40凝胶电泳法的大致机理？ 机理：通过流通电流使物质在电泳板正负极中游动而形成的谱带位置与标准品相比较 从而判断检测的物质。41影响核酸保存的关键因素？1、保存液的酸碱度 2、保存湿度 P8842. 提纯的核酸如何保存？固态核酸通常在oc以上低温干燥保存即可。小分子核酸保存温度还可以更低一些。 液态核酸室温容易变性，

12、短期最好低温（4 摄氏度）保存。43. 遗传物质提取过程中有哪些常见的缓冲溶液？EDTA Tris-Hcl TAE TBE TE44. 核酸提取的两个原则？1. 应保证核酸一级结构的完整性 2.排除其他分子的污染45. 核酸提取应注意哪些问题？1.操作简单 2.不要降解（物理、化学、生物）46. 核酸提取的基本步骤？破碎、提取、纯化47. 常见细胞的裂解方式？1、物理法超声波、研磨法或匀浆法2、化学法 EDTA或SDS3、酶解法48. 常见样本的提取方法？1.浓盐法 2.有机溶剂抽提法 3.密度梯度离心法49. 吸附材料结合有哪些常用的介质？硅质材料，阴离子交换树脂，磁珠50去除DNA中的RN

13、A用什么酶？去除RNA中的DNA用什么酶？去除蛋白质用什么酶？ RNase DNase 蛋白酶 K51核酸提取过程中有一步叫酚-氯仿处理的过程，酚、氯仿、异戊醇的作用分别是什么？ 酚：蛋白质变性剂氯仿：分离更彻底，除去氯仿 异戊醇：消泡剂52为什么碱变性是可以从细菌中提取质粒？细胞基因DNA是线性的，把ph升至12,氢键会断裂，基因组会变成线性从而可以分开， 质粒相对基因组DNA要牢固，不容易破裂，仍然保持超螺旋，尽管高ph打断氢键，两个环 形链也不能分开。53电泳的定义/概念/ 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电荷相反的电极移动，称为电泳54电泳的基本原理（分离样品为什么在电泳里迁移速度不一

14、样）？ 带电性质、分子大小、形状等不同55影响电泳分离的主要因素（外因）有哪些？1、电压2、ph缓冲液3、离子强度适量0.02-0.24、电渗5、介质筛孔大小6、缓冲液的黏度 P12356琼脂糖电泳中的琼脂糖是什么？低熔点琼脂糖有什么用途？琼脂糖电泳的孔径是由什么 决定的？琼脂糖电泳尤其适用于什么？如何检测（用什么染色，染色原理）琼脂糖主要是从海洋植物琼脂中提取出来的线性多糖，一般含有多糖、蛋白质和盐等杂 质。低熔点琼脂糖主要应用于染色体DNA琼脂糖内包埋后原位进行内切酶酶切、DNA片段 回收以及小 DNA 片段的分离。琼脂糖浓度适用于分离、鉴定和纯化DNA片段。用EB染色，在紫外灯下，凝胶中

15、IngDNA即能直接观察到。（EB染色n键多，易吸收紫外光显色。P12557.简述琼脂糖电泳的操作步骤？P12558分子量相当的情况下，线性DNA、共价闭环DNA、开环的双链DNA迁移速度顺序是？共价闭合DNA线性DNA开环的双链DNA59聚丙烯酰胺凝胶电泳介质孔径由什么决定？通过改变丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺的浓度比例决定60聚丙烯酰胺凝胶电泳与琼脂糖凝胶电泳相比哪个分辨率更高？为什么？ 聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分子筛效应，又具备静电效应。P12761. 聚丙烯酰胺凝胶电泳为什么要用双层玻璃板灌胶？封闭的双层玻璃平板的夹层中灌胶，仅有顶层的部分凝胶与空气中的氧气接触，从而大

16、大的降低了氧对聚合的抑制作用。62. PCR技术的中文名？目的？原理？请简述答:PCR即聚合酶链式反应。目的:通过重复循环变性、退火、延伸三个基本反应将所需目 的基因在体外成千上百万倍的扩增。原理:模板DNA通过加热至95C使DNA双链解离，使之 形成单链，退火至温度为55-60C引物与单链结合，最后升温至72CDNA模板-引物结合物 在 TaqDNA 聚合酶的作用下进行延伸,重复上述步骤,25-35 个循环就能将待扩目的基因扩增 放大几百万倍。63. PCR过程中需要哪些试剂？分别的作用是什么？答:TaqDNA聚合酶；促进模板DNA与引物结合。引物；与模板DNA结合，是决定PCR 特异性的关

17、键。dNTP；在PCR反应中起原料作用。缓冲液(Tris-HCL)；调节pH。模板DNA、 Mg2+； DNA酶激活剂。KCL；使引物与模板更易配对。液体石蜡；防止水分蒸发64. PCR过程是否需要解旋酶？为什么？答:不需要。DNA双链在加热至95C会自动解离为单链。65. PCR三个环节的温度分别是多少？每个环节的目的是什么？答:变性:95C,是模板DNA变性解链；退火:45-65C,引物与模板DNA单链互补序列配对 结合；延伸:72C,结合物在taqDNA聚合酶的作用下合成新的模板DNA链互补的半保留复制 链。66. PCR是否可以无限多次循环？若不能，一般是几个循环?为什么？答:不可以。

18、一般为25-35次，因为次数过多taqDNA聚合酶活性下降、引物及dNTP浓度 下降、容易发生错配，导致非特异性产物增加。且产物浓度会随着循环的增加而升高，导致 自身相结合而不与引物结合，或产物链缠结在一起，导致扩增效果降低。67引物的设计需要哪些注意事项？.答:1 .引物不能过长，一般为18-30BP。2.引物不能形成发夹结构。3.G/C或A/T碱基应均 匀分布。4.不能形成引物二聚体或发夹结构。5.引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。 6.引物需与模板DNA匹配。68请举例两种PCR技术的名称，并简述大致机理答:1.反转录PCR:mRNA在反转录酶的作用下反转录为CDNA，以cDNA为模

19、板进行PCR扩 增,引物与cDNA第一链退火，在taqDNA聚合酶作用下合成cDNA第二链.再以cDNA第一链和 第二链为模板，反复循环获得大量的cDNA。2. 巢式PCR:由两对引物所组成，外引物扩增产物较长，含有内引物的靶序列，经过两次PCR 放大，获得目的DNA片段。即先用外引物与目的DNA进行扩增，然后取少量的第一次扩增 产物为模板与内引物进行第二次扩增，第二次 PCR 引物与第一次反应产物的序列互补，第 二次 PCR 扩增的产物就是目的产物。69.PCR 技术有什么应用？请举例 答:遗传病诊断、性别鉴定、转基因检测、疾病诊断。70.基因操作的基本步骤是？答:1.用 PCR 或人工合成

20、的方法扩增目的基因。扩2. 用限制性内切酶将目的基因与载体切开。切3. 将目的基因与运载体结合。接4. 将重组 DNA 引入受体细胞。转5. 培养转化细胞，使其大量扩增。增6. 筛选含有重组DNA分子的受体细胞。检71ECORL限制酶能识别的切点碱基序列是？这样的末端叫？答:。 GAATTC/CTTAAG 粘性末端72粘性末端和平末端的区别？末端连接用什么酶？答:用限制性内切酶切割后得到末端齐平的为平末端（TGG/CCA）末端不齐平的为粘性末端 （GAATTC/CTTAAG）。ACC/GGTT4DNA链接酶。73如何避免基因重组中载体的自身环化？答:用细菌性或小牛肠碱性磷酸酶预先处理线性的载体

21、DNA分子，移去其5末端的磷 酸基团。74同聚物加尾法？人工接头连接法？答:同聚物加尾法:在目的基因和载体两端各加入相同的碱基，使其形成粘性末端，在DNA 连接酶的作用下连接。人工接头连接法:将待克隆的DNA与衔接物通过T4DNA连接酶连接，形成粘性末端， 然后用限制性内切酶切割具有衔接物的DNA分子和克隆载体分子，使两者都能产生可以配 对的粘性末端，将待克隆的DNA片段与载体进行连接的方法。75.PCR操作中taq聚合酶在DNA链的3末端加入一个什么碱基？答:碱基T（胸腺嘧啶）76将外源重组分子导入受体细胞的途径有哪些？ 答:转化、转导、显微注射、电穿孔。77转化和转染有何区别？答:转化为感

22、受态大肠杆菌捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程。 转染为感受态大肠杆菌捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程。78转化因子和转化子有何区别？答:转化因子为接了 DNA的质粒。转化子为转化因子接入到宿主细胞内发生的现象。79外源目的基因向真核细胞转入有哪些方法？答:一、借助载体的基因转移。二、不需载体的基因转移:1磷酸钙转染法2、DEAE-葡 聚糖转染法3.聚阳离子-DMSO转染法4.显微注射转基因技术5.电穿孔DNA转移技术 80重组子筛选和鉴定有哪些方法？答：1.遗传学检测法2.核酸分子杂交检测法3.物理检测法（凝胶电泳法、R-环检测法）4.免 疫学检测法（放射性抗体检测法、免疫沉淀检测法）