5.3血红蛋白的提取和分离学习教案

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1、会计学15.3血红蛋白的提取血红蛋白的提取(tq)和分离和分离第一页，共51页。思考思考(sko)1 分离生物大分子的基本思路是什分离生物大分子的基本思路是什么？么？选用一定的物理或化学的方法选用一定的物理或化学的方法(fngf)分分离具有不同物理或化学性质的生物大分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。子。思考思考2 蛋白质的分离和提取蛋白质的分离和提取(tq)的原理是什的原理是什么？么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和

2、力等等，可以用来分离不同蛋白质。和力等等，可以用来分离不同蛋白质。第1页/共50页第二页，共51页。思考思考3 高温灭菌和酒精灭菌分别高温灭菌和酒精灭菌分别(fnbi)利用蛋白质利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性变性(binxng)、变性、变性(binxng)、空、空间结构间结构第2页/共50页第三页，共51页。第3页/共50页第四页，共51页。（一）（一） 凝胶色谱法（分配凝胶色谱法（分配(fnpi)(fnpi)色谱色谱法）法）2. 2.凝胶：凝胶： 大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构

3、成的微小多孔球体，内部有许多构成的微小多孔球体，内部有许多(xdu)(xdu)贯穿的通道。贯穿的通道。 根据根据(gnj)(gnj)被分离物质的蛋白质相对分被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，来子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离。进行分离。1. 1.概念：概念：一、基础知识一、基础知识第4页/共50页第五页，共51页。3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（相对（ ）的蛋白质容易）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（进入凝胶内部的通道，路程（ ），移），移动速度（动速度（ ），而），而（ ）的蛋白质无法进入）的蛋白质

4、无法进入凝胶内部的通道，只能在（凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（移动，路程（ ），移动速度），移动速度（ ），相对分子质量），相对分子质量(zhling)不不同的蛋白质因此得以分离。同的蛋白质因此得以分离。4、具体、具体(jt)过程过程相对分子相对分子(fnz)质量较小质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快第5页/共50页第六页，共51页。第6页/共50页第七页，共51页。第7页/共50页第八页，共51页。 1、概念：在一定的范围、概念：在一定的范围(fnwi)内，内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀

5、释不引起溶液引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。液。 2、作用：、作用： 能够抵制能够抵制(dzh)（ ）对溶液）对溶液的（的（ ）的影响，维持）的影响，维持PH基本不变。基本不变。外界外界(wiji)的酸的酸或碱或碱PH值值（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液第8页/共50页第九页，共51页。3、缓冲溶液、缓冲溶液(hun chn rn y)的配制的配制 通常通常(tngchng)由（由（ ）种缓冲）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得）就可以制得

6、（ ）使用的缓冲液。）使用的缓冲液。12使用使用(shyng)比例比例在不同在不同PH范围内范围内 思考：说出人体血液中缓冲对？思考：说出人体血液中缓冲对？ NaH2PO4 / Na2HPO4H2CO3 / NaHCO3第9页/共50页第十页，共51页。1、概念：指带电粒子在电场、概念：指带电粒子在电场(din chng)作用下发生作用下发生 迁移的过程。迁移的过程。第10页/共50页第十一页，共51页。 2、原理：许多重要的生物大分子，如、原理：许多重要的生物大分子，如（ ）等都具有）等都具有( ) 在在( )下，这些基团会带上下，这些基团会带上（ ） 。在电场的作用下，这些带。在电场的作用

7、下，这些带电分子会向着与其（电分子会向着与其（ ） 移动。移动。 3、本质：电泳利用了待分离样品中各种、本质：电泳利用了待分离样品中各种分子（分子（ ）以及）以及(yj)分子分子本身（本身（ ）、（）、（ ）的不同，使带）的不同，使带电分子产生不同的（电分子产生不同的（ ），从而实），从而实现样品中各种分子的分离。现样品中各种分子的分离。多肽多肽(du ti)、核酸、核酸可解离可解离(ji l)的的基团基团正电或负电正电或负电所带电荷相反的电极所带电荷相反的电极带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速度一定的一定的PH第11页/共50页第十二页，共51页。第12页/共50页第

8、十三页，共51页。（1 1）聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交）聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂甲叉双丙烯酰胺在引发剂( (过硫酸铵和过硫酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用催化剂（四甲基已二胺）的作用(zuyng)(zuyng)下聚下聚合交联成三维网状结构的凝胶合交联成三维网状结构的凝胶 4.分类分类(fn li)：两种常用的电泳两种常用的电泳(din yn)方法方法:琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳(din yn)和聚丙稀酰胺凝胶电和聚丙稀酰胺凝胶电泳泳(din yn)。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率

9、取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。第13页/共50页第十四页，共51页。为了消除静电荷对迁移率的影响可以为了消除静电荷对迁移率的影响可以(ky)在凝在凝胶中加入胶中加入( )。SDS能使蛋白质发生能使蛋白质发生(fshng)完全变性。由几完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是( )。SDS能与各种蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质形成蛋白质SDS复合物，复合物，SDS所带负电荷的所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而

10、量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于迁移率完全取决于( )。 （3 3）SDS-SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳作用聚丙稀酰胺凝胶电泳作用(zuyng)(zuyng)机理机理: :单条肽链的分子量单条肽链的分子量分子的大小分子的大小SDS注意：测定（注意：测定（ ）通常用）通常用十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量第14页/共50页第十五页，共51页。二、二、 实验实验(shyn)操作操作蛋白质的提取和分离一般蛋白质的提取和分离一般

11、(ybn)分为四步：分为四步：(一）一）.样品处理样品处理(chl)和粗和粗分离分离血血液液血浆血浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红血红蛋白蛋白（ ）两个两个a a肽链肽链两个两个一肽链肽链样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定共四条肽链共四条肽链90第15页/共50页第十六页，共51页。第16页/共50页第十七页，共51页。第17页/共50页第十八页，共51页。每个肽链环绕一个亚铁血红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团(j tun)，此基团此基团(j tun)可携带

12、一分子氧或一分子二可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。呈红色。第18页/共50页第十九页，共51页。 思考：（材料的选取）思考：（材料的选取） 用人的红细用人的红细胞提取血红蛋白的原因胞提取血红蛋白的原因(yunyn)是什是什么？么？ 人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量量(hnling)丰富便于提取血红蛋白。丰富便于提取血红蛋白。第19页/共50页第二十页，共51页。目的：去除（目的：去除（ ）方法：（方法：（ ）离心（速度越高和）离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达时间

13、越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层(shngcng)透明的（透明的（ ），将下层），将下层（ ）的红细胞液体倒入（）的红细胞液体倒入（ ）1.红细胞的洗涤红细胞的洗涤(xd)杂质杂质(zzh)蛋蛋白白低速短时间低速短时间黄色血浆黄色血浆暗红色暗红色烧杯烧杯第20页/共50页第二十一页，共51页。洗涤过程洗涤过程(guchng)图解：图解：血液血液(xuy)100mL3g柠檬酸钠柠檬酸钠低速离心低速离心2 min红细胞红细胞血血 浆浆吸出血浆吸出血浆红细胞红细胞5倍体积生理盐水倍体积生理盐水搅拌搅拌10min重复重

14、复(chngf)洗涤洗涤3次，直至上清液没有黄色次，直至上清液没有黄色再加入再加入用（用（ ）的（）的（ ） 质量分数为质量分数为0.9的的氯化钠溶液洗涤氯化钠溶液洗涤,缓慢搅拌缓慢搅拌10MIN，（ ）离心离心.五倍体积五倍体积如此重复洗涤（如此重复洗涤（ ）次，直至上清液中已没有（）次，直至上清液中已没有（ ），表明洗），表明洗涤干净涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。三三黄黄色色生理盐水生理盐水低速短时间低速短时间第21页/共50页第二十二页，共51页。2.血红蛋白血红蛋白(xuhng dnbi)的释放的释放 加（加（ ）（

15、）（ ）体积，再加）体积，再加40体积的（体积的（ ），置于（），置于（ ）上充分搅拌上充分搅拌10分钟分钟, 细胞破裂释放细胞破裂释放(shfng)出血红蛋白出血红蛋白.3.分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移移(zhuny)到离心管内，以到离心管内，以2000r/min的的速度离心速度离心10 min ，试管中的溶液分为，试管中的溶液分为4层层:原血液原血液甲苯甲苯磁力搅拌器磁力搅拌器蒸馏水蒸馏水第22页/共50页第二十三页，共51页。第第1层：（层：（ ）甲苯）甲苯(ji bn)层层第第2层：（层：（ ）色薄层）色薄层(bo cn)固体固体 （ ）的沉淀

16、层，）的沉淀层， 第第3层层: （ ）的液体）的液体(yt) （ ）的水溶液层）的水溶液层 第第4层层:其它杂质（其它杂质（ ）的沉淀层）的沉淀层无色透明无色透明脂溶性物质脂溶性物质白白血红蛋白血红蛋白红色透明红色透明暗红色暗红色第23页/共50页第二十四页，共51页。用用 过滤过滤 ，除，除去去 ，于分液漏斗中静置片于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红刻后，分出下层的红色色(hngs)透明液体。透明液体。滤纸滤纸(lzh)脂溶性沉淀脂溶性沉淀(chndin)层层第24页/共50页第二十五页，共51页。.分离分离(fnl)血血红蛋白红蛋白分离分离(fnl)过程过程:红细胞红细胞混合液混合液高速

17、离心高速离心10min 离心管离心管滤纸滤纸过滤过滤脂类物质脂类物质烧杯烧杯第25页/共50页第二十六页，共51页。取取( )ml的血红蛋白溶液装入（的血红蛋白溶液装入（ ）中，将透析袋放入盛有中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量的物质的量浓度为浓度为20mmol/L的（的（ ）中，）中，pH为（为（ ），透析），透析12小时，目的是小时，目的是（ ）或）或用于更换用于更换(gnhun)样品中的样品中的（ ）。透析袋一般用硝酸纤维素）。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。制成，又称玻璃纸。除去除去(ch q)样品中分子量较小样品中分子量较小的杂质的杂质透析袋透析袋磷酸磷酸(ln sun

18、)缓冲液缓冲液7.0缓冲液缓冲液4. 透析透析（粗分离）（粗分离）1第26页/共50页第二十七页，共51页。第27页/共50页第二十八页，共51页。思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是磷酸磷酸(ln sun)缓冲液，它的目的是什么？缓冲液，它的目的是什么？ 目的是利用缓冲液模拟细胞内的目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，环境，保证保证(bozhng)血红蛋白的正常结构和功能，血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）第28页/共50页第二十九页，共51页。第29页/共50页第三十页，共

19、51页。（二（二).凝胶色谱凝胶色谱(s p)操操作作-1.凝胶色谱凝胶色谱(s p)柱的制作：柱的制作：2.凝胶色谱凝胶色谱(s p)柱的装填：柱的装填：教材图教材图5193.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱血红蛋白的纯化血红蛋白的纯化第30页/共50页第三十一页，共51页。材料材料(cilio)：交联葡聚糖凝胶：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸磷酸缓冲液缓冲液装填装填:2.凝胶色谱凝胶色谱(s p)柱的装填：柱的装填：步骤步骤操作要求操作要求立刻立刻(lk)用磷酸缓冲液洗涤平衡用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液装

20、填悬浮液凝胶颗粒洗脱液凝胶颗粒洗脱液沸水浴沸水浴 凝胶颗粒蒸馏水凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液配制悬浮液计算称量凝胶计算称量凝胶固定色谱柱固定色谱柱第31页/共50页第三十二页，共51页。3.样品样品(yngpn)的加入和洗的加入和洗脱脱第32页/共50页第三十三页，共51页。(三）三）.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）判断（判断（ ）的蛋白质是否达到）的蛋白质是否达到(d do)要求，需要进行蛋白质的鉴定。要求，需要进行蛋白质的鉴定。纯化纯化(chn hu)第3

21、3页/共50页第三十四页，共51页。注意事项注意事项1. 红细胞的洗涤：红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2. 凝胶的预处理：凝胶的预处理： 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡3. 色谱柱的装填：色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。4. 色谱柱成功色谱柱成功(chnggng)标志：红色区带均匀一致地移动。标志：红色区带均匀一致地移动。为什么？为什么？三、操作三、操作(cozu)提示提示第34页/共50页第三十五页，共51页。

22、观察你处理的血液样品离心后是否分层（见观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图教科书图5-185-18），如果分层不明显，可能是），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间外，离心速度过高和时间(shjin)(shjin)过长，过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。度。四、四、 实验实验(shyn)结果分结果分析与评价析与评价第35页/共50页第三十六页，共51页。由于凝胶是一种半透明的

23、介质，因此可以在由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀查凝胶是否装填得均匀(jnyn)(jnyn)。此外，还。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖糖20002000或红色葡聚糖，观察色带移动的情或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀况。如果色带均匀(jnyn)(jnyn)、狭窄、平整，、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以

24、消除气泡，消除不了时要重新装柱。消除不了时要重新装柱。 第36页/共50页第三十七页，共51页。知识知识(zh shi)总结总结血血红红蛋蛋白白(xuhng dnbi)的的提提取取和和分分离离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱凝胶色谱法法原原 理理分离过程分离过程凝胶电泳凝胶电泳法法缓冲溶液缓冲溶液组组 成成作作 用用蛋白质的蛋白质的提取分离提取分离样品处理样品处理粗粗 分分 离离纯纯 化化纯度鉴定纯度鉴定第37页/共50页第三十八页，共51页。血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。包括：样品处理、粗分离、

25、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤首先通过洗涤(xd)(xd)红细胞、血红蛋白的释红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（质，即（ ）；然后通过凝胶）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（即样品的（ ）；最后经聚丙烯酰胺凝胶）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（电泳进行（ ）。）。思考思考(sko)样品样品(yngpn)(yngpn)的粗分离的粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定第38页/共50页第三十九页，共

26、51页。血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观非常直观(zhgun)(zhgun)，大大简化了实验操，大大简化了实验操作。作。 思考思考(sko)第39页/共50页第四十页，共51页。1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究的研究(ynji)和应用越来越深入，首先要和应用越来越深入，首先要做的一步是做的一步是A 弄清各种蛋白质的空间结构弄清各种蛋白质的空间结构B 弄清各种

27、蛋白质的功能弄清各种蛋白质的功能C 弄清各种蛋白质的合成过程弄清各种蛋白质的合成过程D 获得高纯度的蛋白质获得高纯度的蛋白质第40页/共50页第四十一页，共51页。2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是于蛋白质的叙述，正确的是A 相对分子相对分子(fnz)质量较小的蛋白质行程质量较小的蛋白质行程大于相对分子大于相对分子(fnz)质量较大的蛋白质质量较大的蛋白质B 相对分子相对分子(fnz)质量较小的蛋白质行程质量较小的蛋白质行程小于相对分子小于相对分子(fnz)质量较大的蛋白质质量较大的蛋白质C 相对分子相对分子(fnz)质量较小的蛋

28、白质行程质量较小的蛋白质行程等于相对分子等于相对分子(fnz)质量较大的蛋白质质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较二者根本无法比较第41页/共50页第四十二页，共51页。3、使用、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全同蛋白质的电泳迁移率完全(wnqun)取取决于决于A 电荷的多少电荷的多少 B 分子的大小分子的大小C 肽链的多少肽链的多少 D 分子形状的差异分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A 调节调节pH B 维持红细胞的能量供应维持红细胞的能量供应C 防止微生物生长防止微生物生长 D 防止血液

29、凝固防止血液凝固第42页/共50页第四十三页，共51页。5、一分子血红蛋白最多可携带的、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数和分子数和CO2分子数分别是分子数分别是A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、16、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序顺序(shnx)自上而下是：自上而下是：有机溶剂有机溶剂-脂类物质脂类物质-血红蛋白溶液血红蛋白溶液-红红细胞破碎物沉淀细胞破碎物沉淀第43页/共50页第四十四页，共51页。B第44页/共50页第四十五页，共51页。8.凝胶色谱柱取长为凝胶色谱柱取长为40 cm，内径为，内径为16 cm，有关说法中，

30、正确的是，有关说法中，正确的是 (多多选选)（ ）A一般凝胶色谱柱直径一般凝胶色谱柱直径(zhjng)的大的大小不影响分离的效果小不影响分离的效果B凝胶色谱柱过高超过凝胶色谱柱过高超过1 m，不影响，不影响分离的效果分离的效果C凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度分离度D凝胶色谱柱直径凝胶色谱柱直径(zhjng)过大会耗过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大用过多洗脱液，样品的稀释度过大第45页/共50页第四十六页，共51页。A第46页/共50页第四十七页，共51页。端，不要破坏凝胶面端，不要破坏凝胶面A第47页/共50页第四十八页，共51页。 A第48页/共50页第四十九页，共51页。第49页/共50页第五十页，共51页。感谢您的观看感谢您的观看(gunkn)。第50页/共50页第五十一页，共51页。