碱性磷酸酶Km值的测定ppt课件
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碱性磷酸酶Km值的测定,1,1.了解酶的Km值测定原理和方法 2掌握碱性磷酸酶(AKP)活性测定的原理和方法,【实验目的】,2,在温度,PH及酶浓度恒定的条件下,酶促反应的初速度随底物浓度(S)增大而增加,但当底物浓度增大到一定极限时,则反应速度趋于恒定,此最大反应速度Vmax,反应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方程来表示,即:,【实验原理】,3,VmaxS V= Km + S 其中Km为米氏常数, Vmax为最大反应速度, 当V=Vmax/2时,则Km=s。 Km是酶的特征常数,测定Km是研究酶的一种方法,4,将米氏方程变形为双倒数方程,以l/ v1s作图,将各点连线,在横轴截距为-km,据此可算出Km值。 1/V=Km/ VmaxS + 1/ Vmax,5,S,底物浓度与反应速度关系曲线,双倒数曲线,6,本实验以碱性磷酸酶为例,用磷酸苯二钠为其底物,生成酚和磷酸,酚在碱性溶液中与4一氨基安替比林作用,经铁氰化钾氧化生成红色醌的衍生物,根据红色的深浅可测出酶活力高低。其反应式如下: 磷酸苯二钠+H2O AKP OH- 苯酚 苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物 (红色) 光密度与颜色,颜色与酚,酚与酶活性成正比,故以1/A 取代1/v 作为纵坐标作图,7,1. 0.04 M(40mM) 磷酸苯二钠溶液(底物液) 2. 0.1 M 碳酸盐缓冲液(pH 10.0) 3. 0.05 mg/ml 碱性磷酸酶溶液(Ap) 4. 0.5 M NaOH 5. 0.3 % 4-氨基安替比林 6. 0.5% 铁氰化钾,【实验试剂】,8,【实验操作】,混匀后37水浴,预温5分钟左右,9,加入酶液后立即混匀(保持37水浴),反应开始。 从加入酶液起计时至下一步 加入碱性溶液停止反应,各管反应时间应准确一致,为15分钟。,10,混匀,室温放置10分钟左右, 以8号管为空白,于5l0nm比色,记录各管的光密度,11,【实验结果】,1、原始数据,12,以1s为横轴,1OD510为纵轴作图,观察曲线形状;查Km 值,2、作图,13,- 配套讲稿:
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