琼脂糖分离介质征求意见稿.doc
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1中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准GB/T-201琼脂糖分离介质Agarose-based chromatographic medium(征求意见稿)200-发布 200-实施ICS 07.080A 20/39中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2前 言本标准参考了 GB/T 1.12009 的规则编写。本标准由中国标准化研究院提出并归口。本标准起草单位:本标准主要起草人:3琼脂糖分离介质1 范围本标准规定了琼脂糖分离介质的技术要求、检测方法、检验规则、标志、包装、运输和贮存。本标准适用于骨架为琼脂糖微球的分离介质的生产与检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 601 化学试剂标准滴定溶液的制备GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备3 术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 琼脂糖分离介质 agarose-based chromatographic medium琼脂糖分离介质是以琼脂糖为主要原料制备得到的一类层析介质。4 技术要求4.1 外观在光学显微镜下球形饱满,表面光滑,透明性良好。4.2 理化性质琼脂糖分离介质的理化性质应符合表1中的规定。4表1 琼脂糖分离介质技术要求5 试验方法本方法中所用的水,在未注明其他要求时,应符合GB/T 6682中二级水的规格,所用试剂,在未注明其他规格时,均指分析纯(AR ) 。5.1 外观5.1.1 仪器5.1.1.1 光学显微镜。5.1.1.2 真空泵:极限真空 0.1MPa。技术指标检验项目4%琼脂糖分离介质 6%琼脂糖分离介质 FF粒度范围/%(45165m)90(2444m)90(45165m)90(2444m)90平均粒径( m) 97.512.5 34.006 95.514.5 35.511.5在 0.1 Mpa 压力下可达最高流速*( cm/h) 210 60 270 60固含量(%) 7.501.60 10.502.00Mp=20000 0.59-0.66 0.61-0.68 0.48-0.53 0.54-0.59Mp=50000 0.64-0.71 0.66-0.73 0.69-0.77 0.75-0.83分配系数Kav(葡聚糖)Mp=10000 0.79-0.88 0.79-0.87 0.72-0.80 0.77-0.85非特异性吸附(g 细胞色素 C/mL 介质)18 18 18 18微生物污染(菌落数 /mL 悬浮液)100 100pH 3.0 0.21 0.21 0.35 0.35化学稳定性(脱落物羟甲基糠醛测定,%)pH 13.0 0.17 0.17 0.17 0.17*:层析柱 1.60 cm20.00 cm(介质床层高度 10.00 cm), 温度 22(3), 溶液为 H2O 的条件下测定。55.1.2 测定步骤 5.1.2.1 样品处理用量筒量取 5 mL 琼脂糖白球,置于 50 mL 砂芯漏斗中。用三级水清洗 5 次每次 2 min,抽干 5 min。将洗净的琼脂糖白球置于烧杯中,琼脂糖白球上应有 2 cm 的三级水。混匀后得到琼脂糖白球与水的混合体系。5.1.2.2 样品观测前处理用塑料吸管吸取 1 mL 琼脂糖白球与水的混合体系置于载玻片上,调整显微镜放大倍数。以视野里 80%以上面积均为白球为标准,用塑料吸管增减载玻片上的微球,最后用盖玻片压上。5.1.2.3 样品观测调节光学显微镜焦距,使视野中的影像清晰。拍摄琼脂糖白球照片并保存。5.2 粒径及其分布5.2.1 仪器5.2.2.1 激光粒度仪。5.2.2.2 塑料吸管。 5.2.2.3 玻璃滤瓶。5.2.2.4 砂芯漏斗(G3)。5.2.2.5 真空泵:极限真空 0.10 MPa。5.2.2 测定步骤 5.2.2.1 样品处理方法同 5.1.3.1。5.2.2.2 样品检测设置测量颗粒类型为通用型,分散剂类型为水,分析模式为单峰模式,添加样品进行测定。5.2.4 结果表示通过激光粒度仪的检测结果包括平均粒径值及其分布图,根据粒径分布(如图 1 中表6格)按公式(1)计算 45-165 m 粒径范围内微球数量所占百分比。(1)粒径 =1+2+式中:W 粒径 45-165 m 粒径范围内微球数量所占百分比,单位是% ;W1,W 2,W x符合 45-165 m 范围的各粒径范围百分比,例如图 1 中 45.709 m-52.481 m 的球所占百分比为 5.35%。图 1 琼脂糖分离介质粒径分布图平均粒径的计算方法:=1/其中dBk为单个介质的粒径, 为所统计的一定数量介质颗粒的平均值,N 为所统计的介质颗粒的数目。5.2.5 允许差同一试样三次测定结果之差,应不超过平均值的 5%。5.3 耐受压力强度测试75.3.2 仪器5.3.2.1 中低压层析系统。5.3.2.2 玻璃层析柱: 1.60 cm 20.00 cm。5.3.2.3 玻璃滤瓶。5.3.2.4 砂芯漏斗(G3)。5.3.2.5 真空泵:极限真空 0.10 MPa。5.3.3 测定步骤5.3.3.1 样品处理方法同 5.1.3.1。5.3.3.2 样品装柱将介质与水的混合浆液倒入层析柱中,堵住柱子出口,静置,待柱床层稳定(1.60 cm10.00 cm),柱子上端充满水。打开柱子入口,连续向柱中通入三级水(10 个柱体积),保持床层稳定。5.3.3.3 样品测定将层析柱连入中低压层析系统。测定时,从零开始设定一定流速 Vx(mL/min ),保持该流速 5 min 后,记录此时柱压 Px (MPa)。继续增加流速,并测定相应流速下的柱压。直到压力达到 0.10 Mpa 为止。5.3.4 结果表示按公式(3)计算线速度。以线速度(V )与压力(P x)之间的关系作图,由图读取最大流速(如图 2)。(3)=60式中:V 线速度(cm/h );Vx流速(mL/min);S 层析柱截面积(cm 2)。8图2 琼脂糖分离介质压力-流速曲线5.3.5 允许差同一试样三次测定结果之差,应不超过平均值的 10%。5.4 固含量5.4.1 仪器5.4.2.1 分析天平:精度 0.1 mg。5.4.2.2 离心机:0 4000 r/min(可调);50 mL 玻璃离心管(底部带有 G3 砂芯筛板)4支。5.4.2.3 玻璃滤瓶。5.4.2.4 砂芯漏斗(G3)。5.4.2.5 架盘天平:精度 0.1 g。5.4.2.6 称量瓶: 50 mm 30 mm。5.4.2.7 干燥器: 250 mm,内放硅胶干燥剂。5.4.2.8 烘箱:温度波动2。5.4.2.9 真空泵:极限真空 0.10 MPa。5.4.3 测定步骤95.4.3.1 样品处理方法同 5.1.3.1。5.4.3.2 样品称量将 5 mL 琼脂糖分离介质与水的混合体系装入离心管内,置于离心机,在 2000 r/min下离心 5 min。取出离心管,将样品小心倒入称量瓶内,盖严。在已恒重的两个称量瓶中分别称入上述称重白球样品(1.0-1.5 g) ,精确至 0.1 mg。5.4.3.3 样品烘干称量将称量瓶开盖置于烘箱中,于 1052 干燥 4 h 至恒重。将称量瓶盖严,取出置于干燥器内,冷却 30 min 至室温,称量。5.4.4 结果表示琼脂糖分离介质固含量按公式(4)计算:W G2110(4)式中:W 固含量(%);G1干燥前称量瓶加试样质量( g);G2干燥后称量瓶加试样质量( g);G 称量瓶质量(g)。5.4.5 允许差同一试样三次测定结果之差,应不超过平均值的 5%。5.5 分配系数Kav5.5.1 试剂5.5.1.1 葡聚糖: Mp=200000 ;Mp=50000; Mp=10000。5.5.1.7 Buffer A (50 mM PB-0.15 M NaCl,pH7.0) 缓冲液:称取 10.93 g 磷酸氢二钠、3.04 g 磷酸二氢钠和 8.76 g NaCl,加水溶解,调 pH7.0,最后定容至 1000 mL。105.5.2 仪器5.5.2.1 中低压层析系统。5.5.2.2 玻璃层析柱:1.00 cm 40.00 cm。(柱子长度再修改下)5.5.2.3 0.45 m 过滤膜。5.5.2.4 玻璃滤瓶。5.5.2.5 砂芯漏斗(G3)。5.5.2.6 真空泵:极限真空 0.10 MPa。5.5.3 测定步骤5.5.3.1 样品处理方法同 5.1.3.1。5.5.3.2 样品装柱将介质与水的混合浆液倒入层析柱中,堵住柱子出口,静置,待柱床层稳定(1.00 cm30.00 cm,柱体积 24.00 mL),柱子上端充满水。将层析柱介入中低压层析系统,连续向柱中通入三级水(10 个柱体积),同时保证柱压为 0.3 Mpa,保持床层稳定。5.5.3.3 样品测定以 Buffer A 溶液平衡,流速为 2mL/min,先以 1%浓度丙酮测定内水相体积 Vi,再将不同分子量的葡聚糖单独上样,依次是葡聚糖 Mp=200000 ;葡聚糖 Mp=50000;葡聚糖Mp=10000,样品浓度 2 mg/ml。上样量 200 L。其中葡聚糖 Mp=2000000 测定外水相体积Vo。5.5.4 结果根据公式(5)计算分配系数 Kav 。(5)Kav=Ve-VoVi-Vo式中:Ve 各样品的洗脱体积( mL)Vi内水相体积(mL)Vo、外水相体积(mL)115.5.5 允许差同一试样三次测定结果之差,应不超过平均值的 10%。5.6 非特异性吸附5.6.1 试剂5.6.1.6 细胞色素 C:纯度98%。5.6.1.7 Buffer A (10 mM 醋酸铵,pH4.1)缓冲液:称取 0.77 g 醋酸铵,加水溶解,调pH4.1,最后定容至 1000 mL。5.6.1.8 Buffer B (50mM PB-0.15M NaCl,pH7.0)缓冲液:称取 10.93 g 磷酸氢二钠、3.04 g磷酸二氢钠和 8.76 g NaCl,加水溶解,调 pH7.0,最后定容至 1000 mL。5.6.1.9 细胞色素 C 溶液(4 mg/mL):称取 10 mg 细胞色素 C 溶于 10 mL Buffer A,上样前经 0.45 m 过滤膜进行过滤。5.6.2 仪器5.6.2.1 中低压层析系统。5.6.2.2 玻璃层析柱:1.60 cm 20.00 cm。5.6.2.3 0.45 m 过滤膜。5.6.2.4 玻璃滤瓶。5.6.2.5 砂芯漏斗(G3)。5.6.2.6 真空泵:极限真空 0.10 MPa。5.6.3 测定步骤方法5.6.3.1 样品处理方法同 5.1.3.1。5.6.3.2 样品装柱将介质与水的混合浆液倒入层析柱中,堵住柱子出口,静置,待柱床层稳定(1.60 cm5.00 cm,柱体积 10.00 mL),柱子上端充满水。打开柱子入口,连续向柱中通入三级水(10 个柱体积),保持床层稳定。125.6.3.3 样品测定以 Buffer A 溶液平衡,流速为 2 mL/min,蛋白上样 5 mL。经 Buffer A 溶液淋洗至淋洗液没有蛋白出现,再经 Buffer B 洗脱,收集对应洗脱峰。记录洗脱峰体积 V 洗脱峰(mL )和浓度 C 洗脱峰 (mg/mL)。5.6.4 结果根据公式(4)计算洗脱峰的蛋白含量。(6)=洗脱峰 洗脱峰式中:M 洗脱峰蛋白含量(mg);C 洗脱峰 洗脱峰蛋白浓度( mg/mL);V 洗脱峰 洗脱峰体积(mL)。根据公式(5)计算琼脂糖白球非特异性吸附情况。(5)非特异 =洗脱峰 洗脱峰10 1000式中:W 非特异吸附 非特异性吸附量( g/mL);C 洗脱峰 洗脱峰的蛋白浓度( mg/mL);V 洗脱峰 洗脱峰的体积(mL);5.6.5 允许差同一试样三次测定结果之差,应不超过平均值的 20%。5.7 微生物污染5.7.1 仪器5.7.2.1 空培养皿:9.00 cm。5.7.2.2 锥形瓶。5.7.2.3 恒温箱。5.7.2.4 微量移液器。135.7.2.5 无菌枪头。5.7.2.6 旋涡混合器。5.7.3 测定步骤5.7.3.1 样品前处理在空培养皿底部标记样品名称。按照(GBT 5475-2013 离子交换树脂取样方法)直接从产品中抽取 5 mL 样品,置于 50 mL 砂芯漏斗中抽干 5 min。取 1 mL 抽干介质,加入 1 mL 三级水,采用旋涡混合器混匀样品。将含有 30mL 胰蛋白胨大豆琼脂培养基的锥形瓶进行高温灭菌(121C ,20 min),待培养基冷却到 40C 时,用微量移液器吸取 1 mL 混匀后的样品加入到该锥形瓶中,缓缓混合,把混合物倒入培养皿中,盖好上盖。5.7.3.2 凝固混合物在室温下使混合物凝固。5.7.3.3 孵育把培养皿置于恒温箱中孵育。在孵育期间培养皿需要倒置,在 35中放置 5 天。5.7.4 结果表示孵育期后检查培养皿。计数菌落形成单位数(CFU),估计每毫升样品中微生物的数量。5.7.5 允许差同一试样三次测定结果之差,应不超过 5。5.8 化学稳定性5.8.1 试剂5.8.1.4 1 mM 盐酸(pH 3)。5.8.1.5 三级水(pH 7), GB6682-92分析化学实验室用水的规格及试验方法 。5.8.1.6 100 mM 氢氧化钠( pH 13)。5.8.1.7 甲醇:色谱纯。5.8.1.8 甲醇溶液:10%,吸取 100mL 的甲醇到 1000mL 的容量瓶中,定容。145.8.1.9 标准物质:羟甲基糠醛纯度99%。5.8.1.10 标准储备溶液:准确称取适量的羟甲基糠醛标准物质于 100mL 容量瓶,用 10mL甲醇溶解,定容,配成 0.20mg/mL 的标准储备液。此溶液可在温度低于 4冰箱中冷藏保存两个月。5.8.1.11 标准工作溶液:分别吸取适量的羟甲基糠醛标准储备溶液至 100mL 容量瓶中,用 10%甲醇溶液稀释至刻度,配成 0.01g/mL ,0.03g/mL,0.05g/mL,0.08g/mL, 0.10g/mL,0.20g/mL,1.0g/mL,2.0g/mL,4.0g/mL ,6.0g/mL,10g/mL 标准工作溶液。当天新鲜配制。5.8.2 仪器5.8.2.1 带盖玻璃试管。5.8.2.2 玻璃滤瓶。5.8.2.3 砂芯漏斗(G3)。5.8.2.4 真空泵:极限真空 0.10 MPa。5.8.2.5 旋转蒸发仪。5.8.2.6 高效液相色谱仪:配有紫外检测器。5.8.2.7 注射器:10 mL。5.8.2.8 过滤膜:0.45m。5.8.3 测定步骤5.8.3.1 样品处理方法同 5.1.3.1。5.8.3.2 将样品置于不同 pH 溶液中培养取若干份 1.00 g 抽干白球置于带盖玻璃试管内。将上述 pH 3-13 的溶液各 10mL 分别置于各试管内,平行实验三次。样品管在 40C 条件下培养 7 天。7 天后,上层清液被转移到干净的试管内。5.8.3.3 上机前样品处理上层清液经旋转蒸发(60,50 转/分),定容至 2mL,加入等体积 12M 盐酸,100水解 1h。定容至 5mL。另取 1.00g 抽干白球,加入 4mL 6M 盐酸,100水解 1h。定容至 5mL。用 0.45m 的滤膜过滤,滤液用于液相色谱仪紫外检测器测定。155.8.3.4 色谱测定1)液相色谱条件a) 色谱柱:Diamonsil C18 5m,250 mm4.6mm(i.d.)或相当者;b) 流动相:甲醇+水(10+90);c) 流速:1.0mL/min;d) 检测波长:285nm;e) 柱温:30;f) 进样量:10L。2)液相色谱测定首先测定标准工作溶液在上述色谱条件下的峰面积,以峰面积对相应浓度绘制标准工作曲线,然后测定未知样品,用标准工作曲线对样品进行定量。样品溶液中羟甲基糠醛的响应值应在仪器的线性范围内。在上述色谱条件下,羟甲基糠醛的参考保留时间为 9.79-10.40min 范围内,保留时间随样品浓度变化而变化浓度越低保留时间越小。羟甲基糠醛标准物质色谱图和含有羟甲基糠醛的样品色谱图参加图。图3 羟甲基糠醛标准物质色谱图(其中a为浓度0.01mg/L,b为浓度10mg/L )ba16图4 含有羟甲基糠醛的样品色谱图3)空白试验除不加样品试液外,均按上述步骤进行。5.8.4 结果上清液中的羟甲基糠醛的含量按下式计算获得,计算结果应扣除空白值。(6)=0式中:X不同pH试样中羟甲基糠醛的含量( mg/L);c从工作曲线求得的试样溶液中羟甲基糠醛的含量(mg/L);V试样最终的定容体积(mL);V0试样的取样体积(mL)。介质在不同 pH 溶液中的脱落按下式计算获得。=0100%X不同pH试样中羟甲基糠醛的含量( mg/L);17X0抽干白球试样中羟甲基糠醛的含量(mg/L)。5.8.5 允许差同一试样三次测定结果之差,应不超过平均值的 10%。6 检验规则6.1 总则每批产品应经生产厂的检验部门检验合格后出厂,并附有产品质量合格证明。6.2 取样方法6.2.1 按规定抽取样本(GBT 5475-2013 离子交换树脂取样方法)抽取样品混匀后分作两份,签封。粘贴标签,在标签上注明产品名称、生产厂名及地址、批号、取样日期及地点、取样人姓名。一份送检,一份封存,保留半个月备查。需做微生物检验时,取样器和玻璃瓶应事先灭菌(样品不得接触瓶口) 。6.3 检验分类6.3.1 出厂检验产品出厂前,应由生产厂的质量监督检验部门按本标准规定逐批进行检验,检验合格,并附上质量合格证明的,方可出厂。检验项目:外观、粒径及分布、耐受压力强度测试、非特异性吸附、微生物污染。6.3.2 型式检验检验项目:本标准中全部要求项目。一般情况下,同一类产品的型式检验每半年至少进行一次,有下列情况之一者,亦应进行:a)原辅材料有较大变化时;b)更改关键工艺或设备时;c)出厂检验与上次形势检验结果有较大差异时;18d)国家质量监督检验机构按有关规定需要抽检时。6.4 判定规则检验结果如有感官或 1-2 项理化指标不合格时,可以从该批产品中加倍量抽取样品,对不合格项目进行复检,复检结果只要有一项不合格,判该批产品为不合格。7 标志、包装、运输、贮存 7.1 标志每一包装件上应有清晰、牢固的标志,标明产品名称、型号、体积、生产单位名 称、地址。 7.2 包装产品应包装在塑料瓶或合适的包装容器中,每一包装件应附有合格证。合格证应 标明产品名称、型号、批号、生产日期和检验员。 7.3 运输本产品在运输过程中,应保持在 4-30 C 环境中,避免过冷或过热,注意不要使 层析介质失水。 7.4 贮存本产品应贮存在 4-30 的库房里; 本产品在符合本标准规定的贮运条件下,贮存期为二年,超过贮存期可按本标准 规定进行复验,若复验结果符合标准要求,仍可使用。 _- 配套讲稿:
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