金属螯合层析介质征求意见稿.doc
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1中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准GB/TGB/T-201金属螯合层析介质Metal chelating chromatographic medium(征求意见稿)(草案)200-发布 200-实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会ICS 07.080A 20/392前言本标准参考了 GB/T 1.12009 的规则编写。本标准由中国标准化研究院提出并归口。本标准起草单位:本标准主要起草人:3金属螯合亲和层析介质1 范围本标准规定了金属螯合层析介质的技术要求、检测方法、检验规则、标志、包装、运输和贮存。本标准适用于骨架为琼脂糖微球的金属螯合层析介质的生产与检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。3 术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 金属螯合层析介质 metal chelating chromatographic medium将亚氨基二乙酸(IDA)或者次氮基三乙酸(NTA)键合在高流速琼脂糖微球上,再螯合金属离子 Ni2+(或其它金属离子)而形成的一类层析介质。4 技术要求4.1 外观在光学显微镜下球形饱满,表面光滑,透明性良好。4.2 理化性质金属螯合亲和层析介质的理化性质应符合表1 中的规定。表1 金属螯合层析介质的主要性能参数4检测项目 技术指标粒度范围/%(45.00m165m)90平均粒径(m) 99.0011.00IDA(mol Ni2+/mL) 36配基密度NTA(mol Ni2+/mL) 15.00IDA(mg His-tagged LDH/mL) 40.00动态载量NTA(mg His-tagged LDH/mL) 40.00在 0.1 Mpa 压力下可达最高流速*(cm/h ) 270微生物污染(菌落数/mL 悬浮液) 100pH 3 0.16IDApH 13 0.16pH 3 0.25化学稳定性脱落物(羟甲基糠醛)测定,%NTApH 13 0.25*:层析柱 1.60 cm20.00 cm(介质床层高度 10.00 cm), 温度 22(3), 溶液为 H2O 的条件下测定。5 试验方法本方法中所用的水,在未注明其他要求时,应符合GB/T 6682中二级水的规格,所用试剂,在未注明其他规格时,均指分析纯(AR ) 。5.1 外观5.1.1 仪器5.1.1.1 光学显微镜。5.1.1.2 真空泵:极限真空0.1MPa。5.1.2 测定步骤 5.1.2.1 样品处理用量筒量取5 mL金属螯合层析介质,置于50 mL砂芯漏斗中。用去三级水清洗5次每次2 min,抽干 5 min。将洗净的介质置于烧杯中,介质上应有2 cm的三级水。混匀后得到金属螯合层析介质与水的混合体系。5.1.2.2 样品观测前处理5用塑料吸管吸取1 mL金属螯合层析介质与水的混合体系置于载玻片上,调整显微镜放大倍数。以视野里80%以上面积均为微球为标准,用塑料吸管增减载玻片上的微球,最后用盖玻片压上。5.13 样品观测调节光学显微镜焦距,使视野中的影像清晰。拍摄琼脂糖白球照片并保存。5.2 粒径及其分布5.2.1 仪器5.2.2.1 激光粒度仪。5.2.2.2 塑料吸管。5.2.2.3 玻璃滤瓶。5.2.2.4 砂芯漏斗(G3)。5.2.2.5 真空泵:极限真空 0.10 MPa5.2.2 测定步骤5.2.2.1 样品处理方法同 5.1.3.1。5.2.2.2 样品检测设置测量颗粒类型为通用型,分散剂类型为水,分析模式为单峰模式,添加样品进行测定。5.2.4 结果表示通过激光粒度仪的检测结果包括平均粒径值及其分布图,根据粒径分布(如图 1 中表格)按公式(1)计算 45-165m粒径范围内微球数量所占百分比。(1)粒径 =1+2+式中:W 粒径 45-165m粒径范围内微球数量所占百分比( %) ;W1, W2, Wx符合 45-165m范围的各粒径范围百分比,例如图 2 中 45.709m-52.481m的球所占百分比为 3.08%。6图 2 金属螯合层析介质粒径分布图平均粒径的计算方法:=1/其中dBk为单个介质的粒径, 为所统计的一定数量乳液滴的平均值,N 为所统计的乳液滴的数目。5.2.5 允许差同一试样三次测定结果之差,应不超过平均值的 5%。5.3 配基密度(金属离子(Ni 2+)密度) 测定5.3.1 仪器5.3.2.5 层析柱:1.00 cm20.00 cm。5.3.2.6 滴定管。5.3.2 溶液配制5.3.3.1 氨-氯化铵缓冲液甲, pH 10将氯化铵 68.00 g 溶于蒸馏水 300 mL,加浓氨水 570 mL,用蒸馏水稀释至 1000 m L。5.3.3.2 氨-氯化铵缓冲液乙, pH 10称取氯化铵 5.40 g,加水 50 mL 溶解后,加 35 mL 浓氨水,最后用定容至 100 mL。5.3.3.3 5g/L 铬黑 T 指示液0.50 g 铬黑 T 加盐酸羟胺 4.00 g 溶于 100 mL 乙醇中。5.3.3.4 紫脲酸胺指示剂称取紫脲酸胺 1.00 g,加氯化钠 100.00 g 于研钵内研成粉状,装入棕色干净的广口瓶7中备用。5.3.3.5 EDTA 标准溶液(C EDTA=0.l0 mol/L)5.3.3.5.1 配制称取 40.00 g 乙二胺四乙酸二钠,加热溶于 1000 mL 水中,冷却,摇匀。5.3.3.5.2 标定称取 0.25 g 于 800灼烧至恒重的基准氧化锌,称准至 0.0001 g。用少量水湿润,加5 mL 20%的盐酸溶液使样品溶解,加 10 mL 水,用 10%氨水溶液中和至 pH78,加 10 mL氨-氯化铵缓冲液甲(pH=10)及 5 滴 5 g/L 铬黑 T 指示液,用配制好的乙二胺四乙酸二钠溶液滴定至溶液由紫色变为纯蓝色。同时作空白试验。5.3.3.5.3 计算根据公式(1)计算乙二胺四乙酸二钠标准溶液浓度: CEDTm(V12)0.813(1)式中:CEDTA乙二胺四乙酸二钠标准溶液之物质的量的浓度(mol/L);m氧化锌之质量(g);V1乙二胺四乙酸二钠溶液之用量(mL);V2空白试验用乙二胺四酸二钠之用量(mL);0.08138与 1.00mL 乙二胺四乙酸二钠标准溶液(C EDTA=1.000 mol/L) 相当的以克为单位表示的氧化锌的质量。5.3.4 测定步骤5.3.4.1 样品处理用量筒量取 5 mL 金属螯合层析介质,置于 50 mL 砂芯漏斗中。用三级水清洗 5 次每次 2 min,再用 0.1 mol/L EDTA 溶液清洗 5 次每次 5min 将介质上螯合的金属离子清洗净,最后用三级水清洗 5 次每次 2 min,抽干 5 min。5.3.4.2 装柱称取 2.00 g 抽干的偶联 IDA(或 NTA)配基的琼脂糖微球(螯合金属离子前) ,将其与水的混合浆液倒入层析柱中,堵住柱子出口,静置,待柱床层稳定。柱子上端充满水,放入上筛板。打开柱子入口,连续向柱中通入三级水(10 个柱体积),保持床层稳定。85.3.4.2 样品检测准确量取 50 mL 标定的 0.05 mol/L 的 Ni(NO3)26H2O 溶液,匀速通过柱内,立即收集流出液;用去离子水洗涤珠体表面未被吸附的 Ni2+离子,同时收集流出液,同上步收集的流出液混合。5.3.4.3 滴定反应后的 Ni(NO3)2 溶液用氨水调节 pH 值至 78,加入 50 mL 氨- 氯化铵缓冲液乙,0.25g 紫脲酸胺指示剂,用 0.1mol/L 的 EDTA 标准溶液进行滴定至溶液由黄色变为紫色为终点。记录所消耗的 EDTA 标准溶液的体积,进行计算。5.3.4.4 计算根据公式(2)计算湿胶 Ni2+的螯合量:CN2+= EDTA(VEDTA,0VEDTA,1)W1.420(2)式中,CN2+湿胶 Ni2+的螯合量( mol/ml);CEDTAEDTA 标准溶液的浓度( mol/L);VEDTA,0 反应前的 Ni(NO3)2 溶液消耗 EDTA 标准溶液的体积(mL)升;VEDTA,1 反应后收集到的 Ni(NO3)2 溶液消耗 EDTA 标准溶液的体积(mL);W称量的样品质量(g);1.421g 湿胶的体积为 1.42 mL。5.3.5 允许差同一试样三次测定结果之差,应不超过平均值的 5%。5.4 动态载量5.4.2 仪器5.4.2.1 中低压蛋白层析系统。5.4.2.2 紫外分光光度计。5.4.2.3 pH 计。5.4.2.4 层析柱:1.00 cm20.00 cm5.4.2.5 过滤装置。95.4.2.6 微滤膜:0.45m。5.4.2.7 真空泵:极限真空 0.10 MPa。5.4.3 溶液配制5.4.3.1 Buffer A:20 mM PB+0.1 M NaCl+50 mM 咪唑, pH 7.4准确称取 5.80 g Na2HPO412H2O、0.59 g NaH 2PO42H2O、5.84 g NaCl 和 3.40 g 咪唑,用去离子水溶解定容至 1000 mL,用 1 M NaOH 或 1M HCl 调节 pH 至 7.4,过滤(膜孔径0.45m)。5.4.3.2 Buffer B:20 mM PB + 0.1 M NaCl + 0.5 M 咪唑, pH 7.4准确称取 2.90 g Na2HPO412H2O、0.29 g NaH 2PO42H2O、2.92 g NaCl 和 17.02 g 咪唑,用去离子水溶解定容至 500 mL,用 1 M NaOH 或 1 M HCl 调节 pH 至 7.4,过滤(膜孔径0.45 m)。5.4.3.3 His-tagged LDH 溶液准确称取 300 mgHis-tagged LDH 冻干粉(用纯水透析后冻干),溶解于 100 mL Buffer A 中,浓度为 3 mg/ml,过滤(膜孔径 0.45 m)。5.4.4 测定步骤5.4.4.1 样品处理方法同本标准 5.1.3.1。5.4.3.3 装柱将介质与水的混合浆液倒入层析柱中,堵住柱子出口,静置,待柱床层稳定(1.60 cm5.00 cm),柱子上端充满水。打开柱子入口,连续向柱中通入三级水(10 个柱体积),保持床层稳定。5.4.3.4 动态载量测定将层析柱连在层析系统中,对载量测定过程进行监控。用 Buffer A 以 1mL/min 流速平衡层析柱 10 个柱体积(CV),以预纯化的 His-tagged LDH 溶液(蛋白浓度 3.0 mg/ml)上样,流速 2 mL/min,待紫外信号达到原料紫外吸收值的 50%后停止上样,再用 Buffer A 淋洗至基线,再用 Buffer B 洗脱,收集洗脱峰。用纯水冲洗彻底置换出 Buffer B,然后用 20%乙醇溶液冲洗,保存层析介质。100120340560750150250 体A28 (mu) 体 (ml)图 3 金属螯合层析介质载量测定层析谱图5.4.5 结果计算以柱出口蛋白浓度 C 与入口蛋白浓度 C0 之比值 C/C0 与流出液体积作图,即介质的穿透曲线。以柱出口蛋白浓度 C 达到入口蛋白浓度 C0 的 50%时,介质的吸附容量为介质的动态载量,根据公式(3)计算: (3)50%=0(10)式中:Q50%介质的动态载量(mg/mL);C0蛋白起始浓度(mg/mL);V1柱出口蛋白浓度 C 达到入口蛋白浓度 C0 的 10%时流出液体积(mL);V0管路的死体积(mL);Vgel介质体积(mL )。5.4.6 允许差同一试样三次测定结果之差,应不超过平均值的 10%。5.5 耐受压力强度测试5.5.2 仪器5.5.2.1 中低压层析系统。5.5.2.2 玻璃层析柱: 1.60 cm 20.00 cm。5.5.2.3 玻璃滤瓶。115.5.2.4 砂芯漏斗(G3)。5.5.2.5 真空泵:极限真空 0.10 MPa。5.5.3 测定步骤5.5.3.1 样品处理方法同 5.1.3.1。5.5.3.2 样品装柱将介质与水的混合浆液倒入层析柱中,堵住柱子出口,静置,待柱床层稳定(1.60 cm10.00 cm),柱子上端充满水。打开柱子入口,向柱中通入一定体积去离子水(10 个柱体积左右),保持床层稳定。5.5.3.3 样品测定将层析柱连入中低压层析系统。测定时,从零开始设定一定流速 Vx(mL/min ),保持该流速 5 min 后,记录此时柱压 Px (MPa)。继续增加流速,并测定相应流速下的柱压。直到压力达到 0.10 Mpa 为止。5.5.4 结果表示按公式(4)计算线速度。以线速度与压力之间的关系作图,由图读取最大流速(如图3)。(4)=60式中:V 线速度(cm/h );Vx流速(mL/min);S 层析柱截面积(cm 2)。12图 4 金属鳌合层析介质压力-流速曲线5.5.5 允许差同一试样三次测定结果之差,应不超过平均值的 10%。5.6 微生物污染5.6.3 测定步骤5.6.3.1 样品前处理在空培养皿底部标记样品名称。按照(GBT 5475-2013 离子交换树脂取样方法)直接从产品中抽取 5 mL 样品,置于 50 mL 砂芯漏斗中抽干 5 min。取 1 mL 抽干介质,加入 1 mL 三级水,采用旋涡混合器混匀样品。将含有 30mL 胰蛋白胨大豆琼脂培养基的锥形瓶进行高温灭菌(121C ,20 min),待培养基冷却到 40C 时,用微量移液器吸取 1 mL 混匀后的样品加入到该锥形瓶中,缓缓混合,把混合物倒入培养皿中,盖好上盖。5.6.3.2 凝固混合物在室温下使混合物凝固。5.6.3.3 孵育把培养皿置于恒温箱中孵育。在孵育期间培养皿需要倒置,在 35中放置 5 天。135.6.4 结果表示孵育期后检查培养皿。计数菌落形成单位数(CFU),估计每毫升样品中微生物的数量。5.6.5 允许差同一试样三次测定结果之差,应不超过 5。5 化学稳定性5.7.1 试剂与材料5.7.1.9 标准物质:羟甲基糠醛纯度99%。5.7.1.10 标准储备溶液:准确称取适量的羟甲基糠醛标准物质于 100mL 容量瓶,用 10mL甲醇溶解,定容,配成 0.20mg/mL 的标准储备液。此溶液可在温度低于 4冰箱中冷藏保存两个月。5.7.1.11 标准工作溶液:分别吸取适量的羟甲基糠醛标准储备溶液至 100mL 容量瓶中,用 10%甲醇溶液稀释至刻度,配成 0.01g/mL ,0.03g/mL,0.05g/mL,0.08g/mL,0.10g/mL,0.20g/mL ,1.0g/mL,2.0g/mL,4.0g/mL,6.0g/mL,10g/mL 标准工作溶液。当天新鲜配制。5.7.2 仪器5.7.2.1 带盖玻璃试管。5.7.2.2 玻璃滤瓶。5.7.2.3 砂芯漏斗(G3)。5.7.2.4 真空泵:极限真空 0.10 MPa。5.7.2.5 旋转蒸发仪。5.7.2.6 高效液相色谱仪:配有紫外检测器。5.7.2.7 注射器:10 mL。5.7.2.8 过滤膜:0.45m。5.7.3 测定步骤145.7.3.1 样品处理方法同 5.1.3.1。5.7.3.2 将样品置于不同 pH 溶液中培养取若干份 1.00 g 抽干白球置于带盖玻璃试管内。将上述 pH 3-13 的溶液各 10mL 分别置于各试管内,平行实验三次。样品管在 40C 条件下培养 7 天。7 天后,上层清液被转移到干净的试管内。5.7.3.3 上机前样品处理上层清液经旋转蒸发(60,50 转/分),定容至 2mL,加入等体积 12M 盐酸,100水解 1h。定容至 5mL。另取 1.00g 抽干白球,加入 4mL 6M 盐酸,100水解 1h。定容至 5mL。用 0.45m的滤膜过滤,滤液用于液相色谱仪紫外检测器测定。5.7.3.4 色谱测定1)液相色谱条件a) 色谱柱:Diamonsil C18 5m,250 mm4.6mm(i.d.)或相当者;b) 流动相:甲醇+水(10+90);c) 流速:1.0mL/min;d) 检测波长:285nm;e) 柱温:30;f) 进样量:10L。2)液相色谱测定首先测定标准工作溶液在上述色谱条件下的峰面积,以峰面积对相应浓度绘制标准工作曲线,然后测定未知样品,用标准工作曲线对样品进行定量。样品溶液中羟甲基糠醛的响应值应在仪器的线性范围内。在上述色谱条件下,羟甲基糠醛的参考保留时间为 9.79-10.40min 范围内,保留时间随样品浓度变化而变化浓度越低保留时间越小。羟甲基糠醛标准物质色谱图和含有羟甲基糠醛的样品色谱图参加图。aa15图 5 羟甲基糠醛标准物质色谱图(其中 a 为浓度 0.01mg/L,b 为浓度 10mg/L)图 6 含有羟甲基糠醛的样品色谱图3)空白试验除不加样品试液外,均按上述步骤进行。5.7.4 结果上清液中的羟甲基糠醛的含量按下式计算获得,计算结果应扣除空白值。(6)=0式中:X不同pH试样中羟甲基糠醛的含量( mg/L);c从工作曲线求得的试样溶液中羟甲基糠醛的含量(mg/L);V试样最终的定容体积(mL);V0试样的取样体积(mL)。b16介质在不同 pH 溶液中的脱落按下式计算获得。=0100%式中:X不同pH试样中羟甲基糠醛的含量( mg/L);X0抽干白球试样中羟甲基糠醛的含量(mg/L)。5.7.5 允许差同一试样三次测定结果之差,应不超过平均值的 10%。6 检验规则6.1 总则每批产品应经生产厂的检验部门检验合格后出厂,并附有产品质量合格证明。6.2 取样方法6.2.1 按规定抽取样本(GBT 5475-2013 离子交换树脂取样方法)抽取样品混匀后分作两份,签封。粘贴标签,在标签上注明产品名称、生产厂名及地址、批号、取样日期及地点、取样人姓名。一份送检,一份封存,保留半个月备查。需做微生物检验时,取样器和玻璃瓶应事先灭菌(样品不得接触瓶口) 。6.3 检验分类6.3.1 出厂检验产品出厂前,应由生产厂的质量监督检验部门按本标准规定逐批进行检验,检验合格,并附上质量合格证明的,方可出厂。检验项目:外观、粒径及分布、耐受压力强度测试、配基密度、动态载量、微生物污染。6.3.2 型式检验17检验项目:本标准中全部要求项目。一般情况下,同一类产品的型式检验每半年至少进行一次,有下列情况之一者,亦应进行:a)原辅材料有较大变化时;b)更改关键工艺或设备时;c)出厂检验与上次形势检验结果有较大差异时;d)国家质量监督检验机构按有关规定需要抽检时。6.4 判定规则检验结果如有感官或 1-2 项理化指标不合格时,可以从该批产品中加倍量抽取样品,对不合格项目进行复检,复检结果只要有一项不合格,判该批产品为不合格。7 标志、包装、运输、贮存7.1 标志每一包装件上应有清晰、牢固的标志,标明产品名称、型号、体积、生产单位名称、地址。7.2 包装产品应包装在塑料瓶或合适的包装容器中,每一包装件应附有合格证。合格证应标明产品名称、型号、批号、生产日期和检验员。7.3 运输本产品在运输过程中,应保持在 4-30环境中,避免过冷或过热,注意不要使层析介质失水。7.4 贮存本产品应贮存在 4-30的库房里;本产品在符合本标准规定的贮运条件下,贮存期为二年,超过贮存期可按本标准规定进行复验,若复验结果符合标准要求,仍可使用。18_- 配套讲稿:
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