《人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中氨基酸检测方法》征求意见稿
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ICS 11.040.30C 30YY中 华 人 民 共 和 国 医 药 行 业 标 准YY/T XXXXXXXXX人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中氨基酸检测方法 Medical devices for human assisted reproductive technologyThe test method for amino acids in human assisted reproductive medium(征求意见稿)XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施国 家 药 品 监 督 管 理 局 发 布YY/T XXXXXXXXXI目 次前言 II1 范围 .12 规范性引用文件 .13 术语、定义 .14 方法一:氨基酸分析仪测定氨基酸含量 225 方法二:高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪测定氨基酸含量 .36 方法三: 高效液相色谱衍生法测定氨基酸 .7YY/T XXXXXXXXXII前 言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家药品监督管理局提出。本标准由中国食品药品检定研究院归口。本标准起草单位: 本标准主要起草人: YY/T XXXXXXXXX1人类辅助生殖技术用医疗器械 培养用液中氨基酸检测方法1 范围本标准规定了用本标准规定了氨基酸分析仪、高效液相色谱、高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪检测人类辅助生殖技术用液中氨基酸成分。本标准适用于人类辅助生殖技术用液中所含甘氨酸(GLY) 、亮氨酸(LEU) 、蛋氨酸(MET) 、酪氨酸(TYR) 、组氨酸(HIS ) 、苏氨酸(THR) 、丙氨酸(ALA ) 、异亮氨酸(ILE) 、色氨酸(TRY) 、胱氨酸(CYS) 、赖氨酸(LYS) 、天门冬氨酸(ASP) 、缬氨酸(VAL) 、苯丙氨酸(PHE) 、脯氨酸(PRO) 、丝氨酸(SER) 、谷氨酸(GLU) 、精氨酸(ARG) 、牛磺酸(TAU)19种氨基酸的定量分析。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。JJG 10642011 氨基酸分析仪检定规程YY/T 0995-2015 人类辅助生殖技术用医疗器械 术语和定义3 术语、定义YY/T 0995-2015界定的以及下列术语和定义适用于本标准。3.1 高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪 high-performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry, LC-MS/MS高效液相色谱将样品中的待测成分初步分离开,三重四级杆质谱仪对分开的待测成分通过筛选母离子质核比得到待测离子,待测离子经碰撞后碎裂成子离子,最后通过子离子的碎片强度定量待测成分。3.2 氨基酸分析仪 amino acid analyzer,AAA氨基酸分析仪中离子交换色谱柱将样品中不同的氨基酸分离,并以茚三酮做柱后衍生后,在570nm和440nm波长下测定,以外标法进行定量。3.3 高效液相色谱柱前衍生法 (HPLC pre-column derivatization and analysis method) YY/T XXXXXXXXX2待测组分先通过衍生化反应,转化为衍生化产物,然后再经过色谱柱进行分离。高效液相色谱法中柱前衍生的目的是:通过衍生化反应,使原来不能直接被检测的组分转化为能被所用检测器检测的物质;使被测组分与衍生化试剂有选择地参加反应,而与样品中的其他组分分离; 改变被测组分在色谱柱的出峰次序,使之更有利于分离。4 方法一:氨基酸分析仪测定氨基酸含量4.1 原理不同氨基酸有不同的色谱表现,通过氨基酸分析仪的离子交换色谱法柱分离后,以茚三酮做柱后衍生后进行测定,以外标法定量。4.2 试剂除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682中规定的一级水。4.2.1 不同 pH 和离子强度的洗脱用柠檬酸锂缓冲液:按仪器使用说明书配制或购买。4.2.2 茚三酮溶液:按仪器使用说明书配制或购买。4.2.3 4%磺基水杨酸溶液:称取磺基水杨酸 4 g,加水稀释至 100 mL。4.2.4 19 种氨基酸对照品:可采用有证标准品。4.3 对照品溶液配制4.3.1 氨基酸对照品储备液分别取氨基酸对照品适量至容量瓶中,精密称定,加0.1 mol/L盐酸溶液溶解并定容至刻度,制成氨基酸对照品储备液。称取L-色氨酸对照品适量至容量瓶中,精密称定,加少许水和数滴0.1 mol/L氢氧化钠,使之溶解,加水定容至刻度。4.3.2 混合氨基酸对照品系列溶液移取单个氨基酸对照品储备液适量,置于同一容量瓶中,加水稀释配制成混合氨基酸对照品储备液。将混合氨基酸对照品储备液稀释,配制成混合氨基酸对照品系列溶液。使各氨基酸浓度在10 nmol/mL1000 nmol/mL范围 。4冰箱保存一周。4.4 仪器4.4.1 电子天平,精度为 0.000 1g。4.4.2 氨基酸分析仪茚三酮柱后衍生离子交换色谱仪,要求各氨基酸的分辨率大于90%。4.4.3 高速离心机4.4.4 旋涡振荡器4.5 试样制备YY/T XXXXXXXXX3精密移取一定量样品,加水稀释至各氨基酸浓度在10 nmol/mL1000 nmol/mL范围。样品中如含有蛋白,取样品0.5 mL,加0.5 mL 4%磺基水杨酸,混匀后,15 000 r/min离心10 min,取上清液备用。当上清液中各氨基酸浓度不在10 nmol/mL1000 nmol/mL范围,应用水适当稀释。4.6 分析步骤4.6.1 仪器调试使用混合氨基酸对照品系列溶液注入氨基酸分析仪,参照JJG10642011氨基酸分析仪检定规程及仪器说明书,适当调整仪器操作程序及参数和洗脱用缓冲溶液试剂配比,确认仪器操作条件。4.6.2 测试在上述测试条件下,取混合氨基酸对照品系列溶液和样品溶液(或供试液)20 L,分别注入氨基酸分析仪, 以各氨基酸对照品峰面积为纵坐标,氨基酸对照品浓度为横坐标,绘制各氨基酸标准曲线,计算回归方程。4.7 结果与计算4.7.1 样品中各氨基酸含量样品中各氨基酸含量按公式(1)计算KCiX式中:C i - 根据回归方程计算样品测定液中氨基酸i含量,nmol/mL;Xi- 样品中氨基酸 i含量, nmol/mL;K- 试样稀释倍数。4.7.2 结果表示以两个平行试样测定结果的算术平均值报告结果,保留两位小数。4.7.3 平行样测试每个样品需做平行双样,平行双样测定结果的相对偏差应20%。5 方法二:高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪测定氨基酸含量5.1 原理通过乙腈沉淀辅助生殖用培养液中的蛋白质,离心取得上清液后,通过高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪分离检测,根据保留时间及特征离子质核比定性,外标法定量。5.2 试剂除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为 GB/T 6682 中规定的一级水。5.2.1 乙腈,色谱纯YY/T XXXXXXXXX45.2.2 甲酸,色谱纯5.2.3 19 种氨基酸对照品可采用有证标准品。5.3 氨基酸对照品溶液配制5.3.1 氨基酸对照品储备液分别取氨基酸对照品适量至容量瓶中,精密称定,加0.1 mol/L盐酸溶液溶解并定容至刻度,制成氨基酸对照品储备液。称取L-色氨酸对照品适量至容量瓶中,精密称定,加少许水和数滴0.1 mol/L氢氧化钠,使之溶解,加水定容至刻度。5.3.2 混合氨基酸对照品系列溶液移取单个氨基酸对照品储备液适量,置于同一容量瓶中,加水稀释配制成混合氨基酸对照品储备液。将混合氨基酸对照品储备液稀释,配制成混合氨基酸对照品系列溶液。使各氨基酸浓度在0.05 nmol/mL10.00 nmol/mL范围。5.4 仪器5.4.1 高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪,配电喷雾离子化源(ESI)。5.4.2 电子天平,精度为 0.000 1g。5.4.3 高速离心机5.4.4 涡旋振荡器5.5 试样制备精密移取一定量样品,加水稀释至各氨基酸浓度在0.05 nmol/mL10.00 nmol/mL范围。样品中如含有蛋白,取样品100L,加200 L乙腈,涡旋混匀后,15 000 r/min离心1min,取上清液备用。当上清液中各氨基酸浓度不在0.05 nmol/mL10.00 nmol/mL范围,应用水适当稀释。5.6 分析步骤5.6.1 仪器参考条件5.6.1.1 高效液相色谱仪参考条件色谱柱:填料为3m五氟苯基柱,柱长150 mm,内径2.1 mm的色谱柱或其他性能相似的色谱柱;流动相:A为100%水(含0.1%甲酸溶液);B 为100%乙腈(含0.1%甲酸溶液) ;流速:0.35 mL/min;柱温:40 ;进样量:1.0 L;梯度洗脱程序见表1。YY/T XXXXXXXXX5表 1 流动相梯度洗脱程序 时间(min ) 流动相B 比例(%)1.4 03.5 257.5 358.0 9511.0 9511.5 014 停止5.6.1.2 质谱仪参考条件离子源:电喷雾离子源;离子检测方式:多反应监测;离子源接口电压:-3.0 kV;雾化气:氮气,3.0 L/min;干燥气:氮气,10 L/min;加热气:空气,10 L/min;碰撞气:氩气;脱溶剂管温度:250 ;加热模块温度:400 ;接口温度:300 ;19种氨基酸的质谱分析条件参数见表2。表 2 19 种氨基酸的质谱分析参数成分 定量离子(m/z ) 离子极性 Q1 Prerod bias(V) CE(V) Q3 Prerod bias(V)甘氨酸(Glycine) 75.9030.15正离子 -17.0 -11.0 -30.0丙氨酸(Alanine) 89.9044.10正离子 -22.0 -12.0 -18.0脯氨酸(Proline) 116.070.15正离子 -30.0 -18.0 -14.0丝氨酸( Serine) 105.9060.10正离子 -25.0 -12.0 -11.0缬氨酸(Valine ) 118.0057.10正离子 -12.0 -30.0 -23.0苏氨酸(Threonine) 120.1074.15正离子 -27.0 -13.0 -14.0亮氨酸(Leucine) 132.1030.05正离子 -30.0 -18.0 -29.0异亮氨酸(Isoleucine) 132.1069.15正离子 -30.0 -19.0 -14.0天冬氨酸(Aspartic acid) 134.0074.05正离子 -30.0 -15.0 -14.0赖氨酸(Lysine ) 147.20130.10正离子 -15.0 -16.0 -25.0谷氨酸(Glutamic acid) 147.9084.10正离子 -11.0 -17.0 -17.0蛋氨酸 149.9056.10 正离子 -11.0 -18.0 -11.0YY/T XXXXXXXXX6(Methionine)组氨酸(Histidine) 155.90110.10正离子 -18.0 -15.0 -23.0苯丙氨酸(Phenylalanine) 166.10103.10正离子 -12.0 -29.0 -20.0精氨酸(Arginine) 175.2060.10正离子 -19.0 -16.0 -24.0酪氨酸(Tryrosine) 182.10136.10正离子 -14.0 -15.0 -27.0胱氨酸(Cystine) 241.0073.90正离子 -19.0 -29.0 -15.0色氨酸(Tryptpphan) 205.10188.15正离子 -16.0 -12.0 -23.0牛磺酸(Taurine) 124.1579.90负离子 15.0 22.0 16.0注 1:对不同质谱仪,参数可能存在差异,测定前应将质谱参数优化到最佳。5.6.1.3 仪器调谐按照仪器使用说明书在规定时间和频次内对液相色谱/串联质谱仪进行仪器质量数和分辨率校正,其中仪器质量数偏移在0.5Da 之内,质谱峰半峰宽在0.6Da 0.9Da之间,以确保仪器处于最佳测试状态。注 2:Da,道尔顿 Dalton 的缩写,指以人名命名的原子质量单位。5.6.2 测试在上述测试条件下,取混合氨基酸对照品系列溶液和样品溶液(或供试液)20 L,分别注入仪器, 以各氨基酸对照品峰面积为纵坐标,氨基酸对照品浓度为横坐标,绘制各氨基酸标准曲线,计算回归方程。5.7 结果计算与表示5.7.1 样品中各氨基酸含量样品中各氨基酸含量按公式(2)计算(2)=1式中:C-样品中各氨基酸 i含量, nmol/mL;C1-根据回归方程计算样品测定液中各氨基酸 i含量, nmol/mL;f-稀释倍数。5.7.2 结果表示数据保留至小数点后2位。5.8 质量控制5.8.1 空白分析每次分析至少做一个实验室空白,实验室空白中检出每个目标化合物的浓度不得超过方法的检出限。YY/T XXXXXXXXX75.8.2 校准每批样品应绘制标准曲线,相关系数应0.995,否则重新绘制标准曲线。每20个样品或每批次样品(少于20个样品)应测定一个标准曲线中间浓度点标准溶液,其测定结果与该点浓度的相对偏差应20%,否则,须重新绘制标准曲线。5.8.3 平行样测试每个样品需做平行双样,平行双样测定结果的相对偏差应20%。6 方法三:高效液相色谱柱前衍生法测定氨基酸6.1 原理根据一级氨基酸,在巯基试剂存在下,首先与邻苯二醛(OPA)反应,生成OPA-氨基酸;反应完毕后,加入9-芴甲基氯甲酸甲酯(FMOC),剩余的二级氨基酸与FMOC继续反应,生成FMOC-氨基酸,两次反应生成的氨基酸衍生物经反相高效液相色谱分离后用紫外检测器(或荧光检测器)检测,在一定范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。注 3:本方法可使用市售在线衍生试剂盒,通过高效液相色谱自动进样器进行在线衍生进行测试。6.2 试剂6.2.1 流动相 A 称取十二水合磷酸氢二钠9.0g,十水合四硼酸钠9.5g,加水2000ml ,用盐酸调pH 至8.2。6.2.2 流动相 B取甲醇450ml,乙腈450ml,水100ml,混匀。6.2.3 0.4mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 10.2)取硼酸24.73g,加水800ml溶解,用40氢氧化钠溶液调pH至10.2,然后加水稀释至1000ml 。6.2.4 OPA 溶液取OPA 80mg,乙酰半胱氨酸97mg ,加0.4 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 10.2)7ml,加乙腈1ml 溶解。6.2.5 FMOC 溶液取FMOC 40mg,加乙腈8 mL溶解。6.2.6 稀释液取流动相A 100ml,加磷酸0.5ml,混匀。6.2.7 氨基酸混合对照系列溶液含L-天门冬氨酸、L-苏氨酸等17种常规氨基酸,各组分浓度 c(氨基酸)=2.50(或2.00)mol.mL-1。YY/T XXXXXXXXX86.3 仪器6.3.1 电子天平,精度为 0.0001g。6.3.2 高效液相色谱仪6.3.3 高速离心机6.3.4 旋涡振荡器6.4 试样制备样品中如含有蛋白,取样品1 mL,加1 mL 4%磺基水杨酸,混匀后,15 000 r/min离心10 min,取上清液作为待测液备用。6.5 分析步骤6.5.1 色谱条件色谱柱:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为 15cm,柱内径为 4.6mm,粒径为 3m) ;柱温:50;检测波长:338nm(一级氨基酸) ,262nm (二级氨基酸) 如使用荧光检测器检测, 激发波长 340nm,发射波长 450nm(一级氨基酸) ;激发波长 266nm,发射波长 305nm(二级氨基酸);梯度洗脱条件:见表 3;各氨基酸峰间的分离度均应大于 1.0。表 3 梯度洗脱条件时间(min) 流动相A() 流动相B() 流速(ml/min)0 95 5 1.66 90 10 1.68 90 10 1.610 84 16 1.323 58 42 1.024 57 43 1.630 50 50 1.631 0 100 1.634 0 100 1.635 95 5 1.640 95 5 1.66.5.2 测定精密量取对照品溶液50l,置一5 mL塑料离心管中,精密加入0.4 mol/L硼酸盐缓冲液(pH 10.2)250 L,混匀,精密加OPA溶液50 l,混匀,放置30秒,精密加入FMOC溶液50 L,混匀,放置30秒,精密加稀释剂1.6 mL,精密量取40 l,注入液相色谱仪,记录色谱图;另精密量取供试品溶液50 L 同法测定。6.6 结果计算与表示6.6.1 定量分析YY/T XXXXXXXXX9目标化合物根据定量离子的峰面积,用外标法或内标法定量。6.6.2 结果计算样品中的目标物的质量浓度按公式(3)(3)=1式中:C-样品中各氨基酸的质量浓度 ,nmoL/mL;C1-从标准曲线上查得的试样中各氨基酸的浓度,nmoL/mL;f-稀释倍数。6.6.3 结果表示数据保留至小数点后2位。6.7 质量控制6.7.1 空白分析每次分析至少做一个实验室空白,实验室空白中检出每个目标化合物的浓度不得超过方法的检出限。6.7.2 校准每批样品应绘制标准曲线,相关系数应0.995,否则重新绘制标准曲线。每20 个样品或每批次样品(少于20 个样品)应测定一个标准曲线中间浓度点标准溶液,其测定结果与该点浓度的相对偏差应20%,否则,须重新绘制标准曲线。6.7.3 平行样测试每个样品需做平行双样,平行双样测定结果的相对偏差应20%。_- 配套讲稿:
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