质粒转化大肠杆菌.ppt
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质粒转化大肠杆菌,1、重组质粒的鉴定当质粒的重组或其他载体重组后,通常会发生质粒的重组失败,包括质粒的本身环化。因而要求进行筛选,把重组成功的质粒找出来。在目前常用的质粒和其他载体中含有相应的抗生素抗性基因,若重组成功,或不含质粒的自身环化,抗生素抗性基因表达,被转化的大肠杆菌便具备抵抗相应抗生素的能力,可以在含该抗生素的培养基上生长传代。若重组失败,大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。2、为扩增质粒和其他载体作准备由于大肠杆菌繁殖快,在适宜的条件下繁殖一代仅需要20-30min,而且常用质粒可以在大肠杆菌中增殖达到几百个拷贝。因此,通过对转化成功的大肠杆菌培养,可以在短时间内极大的扩增目的质粒。,一、实验目的,二、实验原理,通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理,制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA,如一些插入目的DNA片段的重组质粒,产生51062107个转化的菌落。当质粒与这些大肠杆菌混合后,质粒粘附在大肠杆菌的表面,在42时,大肠杆菌出现热休克,质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后,加入LB培养液,于37振动培养可使细菌复苏,并且表达质粒编码的抗生素抗性基因,提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代,形成菌落。,三、实验流程:,灭活物/质粒,转化大肠杆菌,挑菌,摇菌,菌液PCR,四、实验方法-冻融法,连接产物灭活70,10min,(冰上解冻)大肠杆菌感受态细胞50l、灭火物10l,混合物,冰上放置30min,42,90sec,冰上2min,加入1000ulLB液体(无抗),37,振荡1h,离心10000rpm,1min,RT,去上清800l,留下200l上清于1.5ul离心管中重悬,涂板,37恒温箱,倒置培养12h(时间不得超过20h),1、无菌落,失败,或培养条件不充分。2、菌落布满如苔样,失败,可能是抗生素浓度不够或失效。3、菌落布满,抗生素浓度太高,失败。4、出现菌落,符合要求。,(1),(2),(3),(4),五、结果分析和失败原因,(1)有菌落,说明转化成功,但有两种可能性:其一,质粒自身环化;其二,重组成功。(2)无菌落,说明实验没成功。(3)菌落布满如苔样,可能是抗生素浓度不够或失效。(4)出现大菌斑,大多数是霉菌污染所致。,1、结果分析,1、平板中的抗生素部分失效,长出的克隆是杂菌。2、倒Ka平板时,培养基太烫,应冷却到50以下加Ka抗生素。2、涂板时来回用力过大,涂布环或者涂布棒灼烧过热,或不待冷却就涂布。3、感受态细胞长时间处在常温状态,会严重影响其转化,操作时动作迅速。4、操作时动作过于剧烈,减少对细胞的机械损伤。切记感受态细胞比较娇嫩。5、操作过程不规范,染菌。,2、转化失败的原因,六、大肠杆菌感受态细胞的制备,(1)从LB平板上挑取新活化的E.coliTOP10单菌落于50mlLB培养基中,37振荡过夜;(2)将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100mlLB液体培养基中,37振荡培养2-3小时至OD6000.5左右;(3)将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4下4100rpm离心10min。(4)弃掉上清,加入30ml0.1mol/L预冷的CaCl2溶液,重悬,冰上放置15-30min后,4下4100rpm离心10min;(5)弃掉上清,加入2ml预冷的0.1mol/L的CaCl,加入无菌甘油300l,重悬混匀,冰上放置几分钟;(6)分装,每管100l,液氮冷冻后,保存于-70冰箱。,七、挑菌、摇菌,(1)离心管标号(2)每个管内吸入650lLB+Ka抗生素(3)用牙签挑取单个菌(4)摇床上摇菌(时间大于8h),准备:离心管、牙签、镊子、LB+抗生素,八、蓝白斑筛选原理,蓝白斑筛选-筛选重组子:根据载体的遗传特征筛选重组子,如-互补、抗生素基因等。现在许多载体都含有一个大肠杆菌DNA的短区段,其中有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点(MCS)。受体菌则含编码-半乳糖苷酶C端aa的序列。当外源基因插入时,二者溶为一体后,有-半乳糖苷酶表达,在生色底物5-溴-4-氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)培养基中形成蓝色菌落。而当有外源基因插入到多克隆原点,从而造成插入失活,而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。,九、菌液PCR验证,加样:easybuffer:2.5l样数DNTP:1.5l样数M13R:1l样数M13F:1l样数easyTaq:0.2l样数,混匀、离心,分装,样品,跑电泳,跑PCR,混匀、离心,加菌液1l(酒精灯前),电泳图:,谢谢!,- 配套讲稿:
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- 质粒 转化 大肠杆菌
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