DB21∕T 1888-2011 鸡传染性支气管炎诊断技术规范.doc
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ICS65.020.30B41备案号:DB21辽宁省地方标准DB 21/ T18882011鸡传染性支气管炎诊断技术规程Diagnostic techniques procedures for Avian Infectious Bronchitis点击此处添加与国际标准一致性程度的标识2011 - 01 - 17发布2011 - 02 - 01实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/ T2010前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则并起草。 本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。 本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。 本标准主要起草单位:辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。 本标准起草人: 李清竹、薛树山、顾贵波、王竹、段亚良、李井春、马君敏、邓文超、郑红玲。8鸡传染性支气管炎诊断技术规程1 范围本标准规定了鸡传染性支气管炎病毒的病原分离、微量血凝抑制试验、琼脂凝胶免疫扩散试验、RT-PCR诊断方法本标准适用于辽宁省境内的鸡传染性支气管炎诊断、流行病学普查和检疫。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 18935-2003 口蹄疫诊断技术标准GB/T 19438.1-2004 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法标准GB/T 23197-2008 鸡传染性支气管炎诊断技术标准NY/T 541-2002 动物疫病实验室检验采样方法3 临床诊断3.1 临床症状由于病毒的组织嗜性不同,临床症状表现出一定差异。根据病毒感染鸡只所表现临床症状的不同,可将鸡传染性支气管炎分为以下致病型:a) 呼吸型: 临床突然发生,并迅速传播全群。5周龄以下病雏表现明显,伸颈,张口呼吸,啰音、咳嗽、喷嚏和甩鼻。6周龄以上鸡症状较轻。突出症状是气管啰音、气喘、呼吸困难。b) 肾型:表现为肾炎、肠炎,并伴有呼吸道症状。发病2d3d开始死亡,经6d11d达死亡高峰。病鸡死亡率在30%左右。c) 腺胃型:病死鸡表现为肠炎、严重脱水、极度消瘦。多伴有呼吸道症状。d) 肠型:主要表现为脱水症状为主,伴有呼吸道症状。e) 输卵管炎型: 产蛋鸡主要表现为卵巢及输卵管发炎而引起产蛋量显著下降,并在较长时间内出现软壳蛋、畸型和粗壳蛋;蛋质变差,蛋白稀薄呈水样,蛋黄与蛋白分开及蛋白粘附在壳膜上。产蛋鸡有程度不同呼吸道症状。3.2 剖检病变a) 呼吸型:鼻窦、气管、支气管粘膜肿胀,呈浆液卡他性炎。喉头、气管内有灰白色或灰黄色粘液。肺充血、淤血和水肿,或有小灶性肺炎。b) 肾型:剖检时肾脏肿大,表面及实质有大量尿酸盐沉积,有时可见到输尿管内尿酸盐形成的结石。c) 腺胃型:剖检时腺胃肿大,呈球状,腺胃壁增厚,粘膜出血溃疡,胸腺,胰腺和法氏囊明显萎缩。d) 肠型:剖检时气管粘膜出血肿胀,肾脏尿酸盐沉积,肠道粘膜肥厚,充血,盲肠扁桃体出血。e) 输卵管炎型:产卵母鸡卵泡充血,出血,变形,腹腔内有液关卵黄和腹膜炎。18日龄以内的雏鸡输卵管断裂、萎缩或局限性增生,以致造成永久性不能产卵。4 实验室诊断4.1 病原分离与鉴定4.1.1 采样急性呼吸道型的病鸡采取气管,刚扑杀的病鸡采取支气管和肺组织。肾型和产蛋下降型的病鸡采取病肾或输卵管,若分离病毒应采取大肠、扁桃体、或粪便。4.1.2 样品处理4.1.2.1 将病料放在含有青霉素(10000IU/mL)和链霉素(10mg/mL)pH值为7的磷酸盐缓冲盐水内,置冰盒中发送到实验室。4.1.2.2 将病料研磨,加含抗菌素的PBS制成体积分数为20%的组织悬液,冻融3次,以3000g离心20min,取上清液,加入终浓度为1000IU/mL的青霉素和终浓度为1mg/mL的链霉素,37下作用1h后用于鸡胚接种。4.1.3 分离培养 4.1.3.1 取病料上清液,接种于5枚9日龄的SPF鸡胚尿囊腔内,在取5枚接种PBS,接种量均为0.2mL/枚。37孵育。每天照蛋,24h内死亡的鸡胚弃去。收集接种后3d-7d的鸡胚尿囊液,将所有尿囊液混合,用含1000IU/mL青霉素和1mg/mL链霉素的PBS稀释5倍-10倍,继续在鸡胚内传代。典型的毒株通常在鸡胚中传至第2代或第3代时,可见侏儒胚,传至第3代,某些鸡胚可出现死亡。4.1.3.2 将分离物经鸡胚传至3代或3代以上,收获接种后7天仍存活的鸡胚,取胎儿,用剪刀剪除胎儿体外的附属物,并用吸水纸吸干胎儿表面的液体。如接种胎儿重量比对照胚最轻胎儿重量少2g以上者,可初步判定为有病毒感染。4.1.3.3 对病毒的进一步鉴定可通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进行。4.2 血清学诊断4.2.1 微量血凝抑制试验(按照GB/T23197-2008)4.2.2 气管环组织培养血清中和试验(按照GB/T23197-2008)4.2.3 酶联免疫吸附试验 ELISA试验是一种最敏感的血清学方法,可用于鸡群免疫后抗体的检测。已有商品试剂盒出售,应严格按照说明书使用。4.2.4 琼脂凝胶免疫扩散试验 4.2.4.1 材料准备 4.2.4.1.1 器材a) 烧杯b) 直径85mm培养皿c) 孔径4mm的打孔器d) 6号-9号针头e) 微量移液器及吸头 4.2.4.1.2 琼脂扩散抗原 4.2.4.1.3 标准阳性血清 4.2.4.1.4 被检血清无菌采血,分离血清(),4或20保存备用 4.2.4.1.5 琼脂平板配制方法见附录A(规范性附录)。 4.2.4.2 操作方法 4.2.4.2.1 琼脂板打孔 在琼脂糖平皿上,按坐标纸上画好的梅花型(见图1)打孔,孔径4mm,孔间距3mm,挑出孔内琼脂,在火焰上封底。 图1打孔样式4.2.4.2.2 加样 用微量移液器加样,7孔(中央孔)加抗原,1、3、5孔加标准阳性血清,2、4、6孔加待检血清,每孔均以加满不溢出为度。 4.2.4.2.3 反应 加样完毕后,静置10min,放人37带盖的湿盒中反应,分别在12h、24h、36h观察并记录结果。 4.2.4.3 结果判定 4.2.4.3.1 判定方法 将琼脂板置暗背景或强光照射下观察。标准阳性血清孔与抗原孔之间出现一条清晰的沉淀线,则试验成立;若无沉淀线或沉淀线不明显,则试验不成立,应重做。 4.2.4.3.2 判定标准 a) 被检样品孔与中央孔之间形成清晰的沉淀线,并与标准阳性血清孔的沉淀线相融合者,为阳性。 b) 被检血清孔与抗原之间不形成完整的沉淀线,但标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线末端向被检血清孔的内侧弯曲者,为弱阳性。 c) 被检血清孔与抗原之间无沉淀线,标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线直伸向被检血清孔的边沿无弯曲者,判为阴性。 d) 有的被检血清与抗原之间可能出现两条以上沉淀线,其中一条与标准阳性血清一抗原间沉淀线融合者判为阳性;均不融合者为阴性,此沉淀线为非特异性沉淀线。4.3 RT-PCR诊断4.3.1 材料4.3.1.1 样品的采集与处理无菌采集病鸡的肺、气管粘膜,保持48环境尽快送往检测单位。在无菌室内将样品充分研磨,并加入0.04mol/LPBS(pH7.4)(配置见资料性附录B)制成1:5悬液,3000g离心10min,取上清液备用。阳性对照可选用新支二联活疫苗。4.3.1.2 试剂及引物a) Taq DNA聚合酶、b) AMV反转录酶、c) dNTP、d) DL2000 DNA Marker、e) 琼脂糖、f) 核酸提取试剂Trizol、g) 氯仿、h) 异丙醇、i) DEPC水(配置见附录B)、j) d dH2O、k) 75%乙醇溶液(配置见资料性附录B)。l) 引物:特异性引物序列为上游5CACAGA AGT ATT TGA CCC CTT TGA3;下游5 CCG TTC TTA GGA AAC TCG TTG ACA 3。目的片段大小为314bp。4.3.2 方法4.3.2.1 样品总RNA的提取4.3.2.1.1 阳性对照与样品同时提取RNA,实验应使用DEPC水作为阴性对照。4.3.2.1.2 取上清液250L加入用DEPC水处理过的1.5mL离心管中,加入750LTrizol病毒裂解液,颠倒混匀。4.3.2.1.3 室温(24)静置5min,加入200L氯仿,混匀。4.3.2.1.4 静置2min ,412000g离心10min。4.3.2.1.5 小心吸取上清液加入另一干净的用DEPC水处理过的1.5mL离心管中,再加入等体积的异丙醇,混匀。4.3.2.1.6 静置5min ,412000转离心10min。4.3.2.1.7 小心倒掉上清液,加入1000L75%的乙醇溶液(用DEPC水配制,见资料性附录B);413000g离心2min。4.3.2.1.8 小心倒掉上清液,置37温箱5min。4.3.2.1.9 加40LDEPC水溶解-70保存。4.3.2.2 RT反应 在0.2mlPCR管中配制如下体系:上游引物1L下游引物1LRNA模板1L5Buffer(反转录酶)2LdNTP(10mM)1LRNA酶抑制剂0.5LAMV反转录酶0.5LDEPC水3L注: 以上体系置于42反应1h,在冰浴2min。4.3.2.3 PCR反应在0.2mLPCR管中配制如下体系:cDNA2L10PCR Buffer(Mg2+Free)2.5LdNTP Mixture(各2.5mM)2L上游引物1L下游引物1LMgCI21LrTaq DNA聚合酶0.25LddH2O15.25L以上体系按下列程序在PCR仪进行反应:反应程序为: 95 5min 35个循环95 30sec 53 40sec 72 40sec 72 10min 4.3.2.4 电泳4.3.2.4.1 称取1g琼脂糖,加入100mL 1电泳缓冲液。加热溶化后加入5L(10mg/mL)溴化乙锭,混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中,胶板厚5mm左右。依据样品数选择合适的梳子。待凝胶凝固后拔出梳子,将凝胶放入电泳槽内,加电泳液直至淹没凝胶。4.3.2.4.2 取68L PCR扩增产物与23L加样缓冲液混匀后加入凝胶孔内,在其中一孔内加入与样品相同体积的DL2000 DNA Marker。4.3.2.4.3 80100V或电流40 mA50mA电泳30 min40min。4.3.2.5 结果判定电泳结束后,取出凝胶板置于紫外透射仪上打开紫外灯观察。阳性对照在314bp处有明显的目的条带,而阴性对照无任何条带则实验成立。若被检样品在314bp处有明显条带,可判为阳性;否则为阴性。4.4 综合判定4.4.1 IBV的诊断应依据临床症状和病理变化作出初步诊断,确诊应依靠实验室检查。病毒的分离与鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定,RT-PCR适用于该病病原的快速诊断。血清学方法可用于IBV抗体的检测和血清型的鉴定。微量血凝抑制试验群体水平上进行血清学诊断较易操作、特异性强、敏感性高。气管环组织培养血清中和试验操作复杂,仅适用IBV鉴定。4.4.2 当在临床上怀疑有IBV感染时,可根据实际情况由上述几种方法中选用一种或两种方法进行确诊,对于未接种过IBV疫苗,经任何一种方法检测呈阳性结果时,都可最终判定为IBV感染鸡群。对接种过IBV疫苗并在疫苗免疫期内的鸡或已超过疫苗免疫期的鸡,当病毒分离鉴定试验为阳性结果时,可终判为IBV感染鸡;当仅血清学试验呈阳性结果时,应结合病史和疫苗接种进行综合判定,不可一律视为IBV感染鸡。AA附录A (资料性附录)附录A 琼脂平板制作方法用含8%氯化钠的蒸馏水加万分之一叠氮化钠配制成1%琼脂糖,103kPa高压蒸汽灭菌或水浴加热使琼脂充分溶化,加人直径为85mm的培养皿中,每皿16mL,平置,室温下凝固后,置4备用。B附录B (资料性附录)附录BB.1 PBS(磷酸盐缓冲溶液)的配置B.1.1 0.1mol/L PBS氯 氯化钠(NaCI)80.0g氯化钾(KCI)2.0 g磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)30.0 g磷酸二氢钾(KH2PO4)2.0 g蒸馏水1000.0mLB.1.2 0.04mol/L PBS(PH7.27.4)的配制0.1mol/L PBS400 mL蒸馏水600.0mL103k Pa高压蒸汽灭菌30min。4冰箱保存。B.2 75%乙醇的配制B.2.1 1/1000 DEPC水的配制DEPC1.0 mL蒸馏水999.0mL103k Pa高压蒸汽灭菌30min。4冰箱保存。B.2.2 75%乙醇的配制1/1000 DEPC水25.0 mL无水乙醇75.0mL_- 配套讲稿:
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