《吉林省食品安全地方标准 动物源性食品中24种β2-受体激动剂及β-受体阻断剂残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》编制说明
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吉林省食品安全地方标准 动物源性食品中 24 种 2受体阻断剂残留量的测定 液相色谱 编 制 说 明 (征求意见 稿 ) 吉林省 疾病预防控制 中心 二 一 二 年 四 月 - 2 - 目 录 一、 研究背景 二、 任务来源 三、 制定标准的必要性和意义 四、 标准制定的主要 过程 五、 制定标准的原则 和依据 六、 标准主要条款的说明 1、标准的名称 2、标准的范围 3、方法原理 4、前处理条件 5、仪器分析条件 6、检出限 7、线 性范围 8、准确度、精密度 七、标准验证情况说明 八 、 验证结论 九、本标准作为强制性地方标准的建议 十、贯彻标准要求和措施建议 十一、参考文献 一、 研究背景 - 3 - 动物性食品中兽药残留是近几年来国际社会开始研究的食品安全 问题之一 , 目前越来越受到国内外人们的普遍重视。世界各国,特别是西方发达国家加强了对国际贸易动物性食品中兽药残留的检测。饲料中非法添加的 2 断剂 和激素等,引起人们对养殖动物产品的畏惧,这些问题需要从源头开始治理。而在克伦特罗等 2测也从奥运会兴奋剂检测领域向食品禁用兽药监控的确证技术发展。 作为临床上广泛应用于治疗支气管哮喘等症的受体激动剂, 是一类人工合成苯乙胺类药物, 具有脂肪再分配作用和促进生长作用而被滥用于食品动物饲养中,而作为治疗高血压等心血管疾病的受体阻 断剂则是被作为镇静剂滥用于动物运输过程 中 。这两种药物又是国际奥林匹克委员会 禁止使用的兴奋剂。过量滥用该类药物或食用高残留的动物组织均会影响人体健康,出现肌肉振颤、心动过速、心悸、恶心、眩晕和紧张等中毒症状。 国外已经开始对 兽药 的多残留技术开始研究,我国此领域的检测方法仍不完善, 国家 “十五”计划的“ 食品安全关键技术研究”项目提出要建立农药与兽药多 残留检测方法与快速检测技术,其中 兽药要求 2 目前已有的标准中 动物源性食品中多种 液相色谱串联质谱法 ( 22286标准规定了动物源性食品中沙丁胺醇 (特布他林( 塞曼特罗( 塞布特罗( 莱克多巴胺( 克仑特罗( 溴布特罗( 苯氧丙酚胺( 马布特罗( 马贲特罗( 溴代克仑特罗( 共 11 种 串联质谱 - 4 - 的测定方法 。 且只 适用于猪肝和猪肉 中。 农业部 1063号公告 动物尿液中 11种 液相色谱 标准规定了动物尿液中克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、齐帕特罗、氯丙那林、特步他林、西马特罗、西布特罗、马布特罗 等 11种 农业部 1063号公告 饲料中 13种 液相色谱 标准规定了饲料中克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、齐帕特罗、氯丙那林、特布他林、西马特罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗 等13种 。 农业部 1063号公告 饲料中 8种 气相色谱 标准规定了测定饲料中 8种 色谱 农业部 1025号公告 动物源性食品中 联质谱法 标准适用于猪肝、猪肉、牛奶和鸡蛋中特步他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克仑特罗、妥布特罗和喷布特罗 等 9种 单个或混合物残留量的检测。 动物源性食品中 液相色谱 质谱法 ( 1313标准规定了 质谱确证方法。标准适用于猪肉、猪肝、猪肾等动物源性食品以猪屎中克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、特布它林、非诺特罗、福莫特罗、莱克多巴胺、异丙喘宁等 8种 质谱 /质谱测定。 - 5 - 目 前,国 内、外均没有制订出同 时测定 15种以上 2 受体 阻断剂 兽药 在动物源性食品中 多残留 同时 检测 的 方法。 二、 任务来源 任务来源:吉林省卫生厅 任务编号: 17 - 2012 归口单位:吉林省卫生厅 起草单 位:吉林省 疾病预防控制中心 三、 制定标准的必要性和意义 违禁使用兽药的现象引起了国家相关部门的高度重视,在 2009 年国家食品安全风险监测计划中, 已 将兽药残留纳入到专项监测工作中 ,但只检测两种 2克伦特罗和莱克多巴胺) , 2010 年又增加了沙丁胺醇,到2012 年 国家食品安全风险监测计划中 2监测组分 已增加到 9种,监测项目逐年递增的原因是由于一些不法商贩正在使用更多的 2 断剂 ,所以 今后对 2 断剂 的检测组分会不断增加。 因此建立多组分残留定性定量 检测技术势在必行,同时检验方法的研究为我国食品的卫生监督监测建立了快速、灵敏的方法 ,而且 ,检验方法是针对我国食品安全中最为突出的问题和检测常见的污染物所急需的检测方法 ,解决了食品安全的关键技术。 本课题正是针对这一问题开展相关的研究。 目前,对 2 断剂 的分析方法有气 /质联用分析法( S) 1高效液相色谱法( 5酶联免疫法( 7、液质联用法 8。酶联免疫法虽然具有检测灵敏度高、检出限低、快速等特点,但存在假阳性的问题,不能进行定量 分析,并不适用所有的 2 6 - 动剂 及 断剂 。 以满足残留分析的要求,但衍生过程繁琐,对于多组分的 2 断剂由于其之间结构上的差异而受到一次衍生、分离和分析的限制。 然能直接分析,但多数检测器灵敏度偏低,无法同时进行 多 组分 2 断剂 高灵敏度测定,并且由于存在较多的光谱杂质干扰,而导致无法进行确证。近年来, S 正迅速地成为测定 2 有效的定性和定量手段。邵兵等应用 次 化和9 种 212为本方法的研究提 供了极为有价值的信息。 四、 标准制定的主要 过程 1、 前期工作 实验室在 2011 年,通过查阅最新的资料和技术文献,确定了 同时 测定 动物源性食品中 24 种 2受体阻断剂残留量 的技术路线,对方法的检出限、回收率、精密度进行了系统研究,建立了一个操作简便、灵敏度高、选择性好、能为我省大多数的检测机构所使用的方法,为 动物源性食品中 24 种 2受体阻断剂残留量 检测提供了技术依 据。由于目前国家标准和地方标准中 均 没有 同时 测定 动物源性食品中 24 种 2受体阻断剂残留量 的方法,据此向吉林省卫生厅提出食品安全地方标准制定申请。 2、实验室间的验证工作 2012年 5 月,进行了实验室间的验证工作。通过统计分析各个实验室的检测数据,验证了方法的准确度和精密度、检出限等。参加验证的实验室一 - 7 - 致认为:该方法适用于测定 动物源性食品中 24 种 2受体阻断剂残留量 的含量,具有测定结果准确可靠、操作简单、快速等特点。 五、 制 定 标 准的 原则 和依据 本标准编制遵循 “ 先进性、实用性、统一 性、规范性 ” 的原则,尽可能与国际通行标准接轨,注重标准的可操作性,严格 按照 准化工作导则 第 1 部分:标准的结构和编写规则和 准编写规则 第 4 部分:化学分析方法的要求进行编写。 六、 标准主要条款的说明 1、 标准的名称 动物源性食品中 24 种 2受体阻断剂残留量的测定 液相色谱 2、 标准的范围 本标准规定了 动物源性食品中 24种 2受体阻断剂残留量 的 液相色谱 谱 测定方法。本标准适用于 动物源性食品 中 24种 2受体阻断剂残留量 的测定 。 3、 方法原理 样品经酶解、高氯酸沉淀蛋白, 净化和富集,选择沙丁醇胺 - 克伦特罗 莱克多巴胺 内标, 液相色谱 定 24 种 2 4、 前处理条件 动物组织样品绞碎混合均匀,准确量取 5.0 g,置于 50 入 - 8 - 乙 酸 乙 酸钠缓冲溶液( 10 入 5 葡萄 糖苷酸酶 /芳基硫酸酯酶, 50水解 2h,加高氯酸调节 80超声提取 30 出冷却至室温在 8000 r/心 10 淀再用 10 .1 高氯酸溶液提取一次, 合并两次提取液。用 5 的 10000r/待过 6 入上述溶液过柱,弃去过滤液。依次用 5 .1 乙 酸、 5 弃去过滤液和淋洗液, 再用 6 %一氨 水 甲醇 溶液 洗 脱 ,收集洗脱液于玻璃小瓶中,氮气吹干,用 5 酸水定容,涡漩 1 相色谱 定。 5、 仪器分析条件 i. 色谱参考条件 色谱柱: P 18 柱 (100 2.1 m),柱温: 40,样品温度: 25 ,进样体积: 2 L;流动相 甲酸水 溶液 ,流动相 速为 0.3 mL/性流动相梯度洗脱条件 见表 1。 表 1 液相色谱 流动相梯度条件 时间 流动相 A( 酸) 流动相 B( 乙腈) 梯度曲线 0 100 0 起始 100 0 6 6 90 10 1 80 20 1 10 70 30 1 - 9 - 11 0 100 1 12 0 100 1 100 0 1 15 100 0 1 实验 使用了 m 颗粒粒径固定相的色谱柱 ,比传统 有更高的分离能力 , 可以在很高的线速度、流速和反压下进行高效的分离工作 , 并获得快速、高分离度的分离,提高了灵敏度,减少了基质的干扰。超高效液相色谱仪( 快的运行速度不仅提高了仪器的高通量,也减少了检测的时间, 24种 2受体阻断剂 仅用 15 ( 1) 色谱柱的选择 鉴于本方法分离的组分多而且是残留级别的微量检测,选择分离度的色谱分离柱是首要的工作,本 方法 所使用的超高效液相色谱系统,压力可达15000使用 了 m 颗粒粒径固定相的色谱柱 ,比传统 有更高的分离能力 , 可以在很高的线速度、流速和反压下进行高效的分离工作 , 并获得快速、高分离度的分离,提高了灵敏度,减少了基质的干扰。 减少了检测的时间。 分别选用 3种不同规格的色谱柱分离 24种 2 考察分离结果。具体色谱柱规格是: 柱 1: 18(100 m) 柱 2: 3(100m) 柱 3: 18( 100 m) - 10 - 图 1 莱克多巴胺经不同色谱柱的色谱图 从图 1 可以看出莱卡多巴胺经 与 时出峰峰分叉,而用 P 18 不会出现,且对多数组分均获得良好的分离 ,综合考察峰形及分离度、灵敏度,最后选用 P 18 柱。 ( 2) 流动相体系的选择 由于电喷雾质谱的离子化是在溶液状态中电离,因此流动相的组成和添加剂除了影响目标化合物的分离 (保留时间和峰形 )外,还会直接影响到目标化合物的离子 化效率,从而降低目标化合物的检测灵敏度。分别采用 酸水 溶液 、乙腈 酸水 溶液 、乙腈 酸水 溶液 、 酸水 溶液 、乙腈 酸水 溶液 作为流动相考察了不同有机相组成对离子化的影响,同时比较了水相中不同甲酸含量 ( 对灵敏度的影响, 见图 2。实验表明 以乙腈 酸水作为流动相的灵敏度明显高于以甲醇 酸水作为流动相的灵敏度。不同水相的结果比较表明, 甲酸添加量的灵敏度高于其他浓度,低于 离程度不足,而高于 能 会导致离子抑制效应,反而降低了灵敏度,因此,本 方法 选用了 乙腈和 甲酸水溶液作为流动相 , 并优化得到了最佳的梯度洗脱程序 。 在这一洗 - 11 - 脱程序下 , 24种 2受体阻断剂 能得到较好的分离度和色谱峰形 。 质谱条件 离子源 : 离子源:电喷雾电离 (),毛细管电压: 孔电压:35V;射频透镜 1()和射频透镜 2()电压分别为 子源温度: 110;脱溶剂温度: 300;脱溶剂气流量: 600L/h;离子能 1 和 离子能 2 分别为 24种 2受体阻断剂 的质谱采集参数见表 2。 表 2 24种 2 质谱优化条件 名称 保留时间 (离子 /子离子 锥孔电压( V)碰撞电压 (奥西那林 30 18 非诺特罗 32 25 西马特罗 24 10 沙丁醇胺 30 15 塞布 特罗 28 15 丙卡特罗 25 20 克仑塞罗 30 18 克仑 丙 罗 22 10 利妥特灵 30 14 妥布特罗 30 15 克伦特罗 30 16 35 18 - 12 - 30 15 莱卡多巴胺 30 15 溴氯布 特 罗 30 15 福莫特罗 30 25 采用流动注射泵连续进样 , 对各 2 质谱条件进行优化 , 在正 离子和负离子模式下进行了全扫描 , 结果表明:在正离子模式下,这些化合物全扫描的分子离子 M+H 最理想。 同时 分别对 g/ 然后以分子离子为母离子 , 对其子离子进行全扫描 。 找到两个响应信号稳定的子离子作为定性子离子 , 响应信号较强的子离子作为定量子离子 , 并优化得到每种 2 母离子和子离子所需的最佳锥孔电压和碰撞能量 。 离子能 2从原来的 应值随之升高;继续增大离子能,响应值随之下降。这可能由于离子能 2的增加,可以有效地降低基质的 抑制现象。 最后 , 以多反应监测 ( 方式对各种 2 行扫描 。 前处理条件的选择 ( 1) 酶解和酸解 除克仑特罗外, 2 组织中往往与其他成分形成结合物,如与葡萄糖苷酸酶、硫酸酯蛋白相结合,所以样品提取时需用酸或酶水解。对于固体组织样品,蛋白水解酶消化法能有效释放与细胞成分结合的 2 改善提取效率。本 方法 选择用 一盐酸葡萄糖醛甙酶 /芳基硫酯酶进行水解。由于 一盐酸葡萄糖醛甙酶 /芳基硫酯酶在 以本 方法 采用在 酸 - 13 - 冲液中进行。于 50恒温箱中 水解 时间可根据试验需要适当做调整。当莱克多巴胺和克仑特罗 等 阳性样本培养时间增至 3h,莱克多巴胺的 回收率略有增加,克仑特罗无显著变化,所以采用 2 ( 2) 固相萃取柱的选择 2 断剂 有效的净化方法,对于苯胺型和苯酚型均有良好的适用性。由于在 数的 2 解离形式,本 方法 选择阳离子交换柱,将样品加至活化后的 乙 酸溶液和甲醇依次淋洗后,用 氨 水 甲醇 溶液使 2非解离态后洗脱。本方法比较了 ( 3) 上样溶液 的选择 本 标准 中涉及到 24 种 2 各物质的 此在不同的 而影响到目标化合物在 上的吸附。配制不同 (分别从 2 2 0ng/别过 , 结果发现 当 各 2 回收率较理想。 ( 4) 洗脱溶液的选择 分别比较了 5 %氨 水 甲醇 溶液 、 5 %氨 水 乙醇 溶液 、 5 %氨 水 乙酸乙酯溶液作为 洗脱液,结果发现当用 5 %氨 水 乙醇 溶液 、 5 %氨 水 乙酸乙酯溶液 作洗脱液时, 奥西那林 的回收率仅为 45 %,其余 2 回收率在 72 %。 5 %氨 水 甲醇 溶液 作为洗脱液时, 24 种2 回收率均在 75 % 98 %。因此选择 5 %氨 水 - 14 - 甲醇 溶液 作为 洗脱液。 ( 5) 内标的选择 同位素稀 释法是保证液质联用分析技术结果准确的有效途径, 同位素内标应具有与待测化合物相同的化学性质。 本 方法 中涉及到 24 种 2 选择合适的同位素作为内标非常关键。以猪肾为基质,分别比较三种内标物质与 24 种 2 绝对回收率。奥西那林 、西马特罗、沙丁醇胺、塞布特罗选择沙丁醇胺 内标;对于丙卡特罗、非诺特罗、 莱卡多巴胺、妥布特罗、溴 氯布 特 罗 选择莱卡多巴胺 内标,其余受体激动剂 和 择克伦特罗 内标。 考虑到大部分的 2 有较高的回收率,参照欧盟 2002 657 14,可以用批次实验同时测定得到的回收率结果校正样品测定结果,这样仍然可以保证测定结果的准确,故 2 果回收率较高的情况下 仍 可 采用外标法计算。 6、 检出 限 马布特罗、克仑潘特、克仑丙罗、沙丁醇胺、克伦特罗、莱卡多巴胺、溴氯布特罗、溴布特罗、奥西那林、利妥特灵、塞布特罗、苯氧丙酚胺、克仑塞罗、妥布特罗、 喷特罗、西马特罗、苯乙醇胺 A、非诺特罗、福莫特罗、拉贝特罗、异克仑潘特、 丙卡特罗 的检出限 均为 g/ 7、 线性范围 配置 25 ng/50 ng/100 ng/250 ng/500 ng/1000 ng/- 15 - 的标准溶液,其中内含内标浓度为 50 ng/上述溶液 100 L,用阴性基质样品溶液作为定容液,进样分析获得标准曲线。 24种 2 g/g/有很好的线性关系,相关系数 8、 准确度、精密度 在 两种具有最大基质干 扰的动物内脏(猪肝、猪肾)中分别进行三个浓度 g/g/ g/中内标浓度为 g/六个平行的加标实验 ,见图 2用同位素内标来校正回收率, 24 种 2 猪肝、猪肾 、猪肉和牛肉 的加标回收率 和 相对标准偏差 见表 3 和表 4。 图 2 猪肝中加标浓度为 g/谱图 - 16 - 图 3 猪肾中加标浓度为 g/谱图 表 3 24种 2受体阻断剂 不同基质、三个水平 添加回收率范围 化合物 添加水平( g/ 猪肾 /% 猪肝 /% 牛肉 /% 猪肉 /% 奥西那林 586诺特罗 13392 马特罗 54239 丁醇胺 51022 布特罗 54239 卡特罗 - 17 - 化合物 添加水平( g/ 猪肾 /% 猪肝 /% 牛肉 /% 猪肉 /% 72332 仑塞罗 157877 仑丙罗 38339 妥特灵 26652 布特罗 41570 伦特罗 37148 253 51384 卡多巴胺 97825 氯布特罗 N/A 莫特罗 73573 布特罗 41937 布特罗 56341 仑潘特 37158 氧丙酚胺 - 18 - 化合物 添加水平( g/ 猪肾 /% 猪肝 /% 牛肉 /% 猪肉 /% 579 贝特罗 36894 克仑潘特 N/A 喷特罗 54238 乙醇胺 A N/A 4 24种 2受体阻断剂 不同基质、三个水平的相对标准偏差( n=6) 化合物 添加水平( g/ 猪肾 /% 猪肝 /% 牛肉 /% 猪肉 /% 奥西那林 586诺特罗 13392马特罗 54239丁醇胺 51022布特罗 54239卡特罗 72332仑塞罗 157877仑丙罗 - 19 - 化合物 添加水平( g/ 猪肾 /% 猪肝 /% 牛肉 /% 猪肉 /% 38339妥特灵 26652布特罗 41570伦特罗 3714825351384卡多巴胺 97825氯布特罗 N/A 莫特罗 73573布特罗 41937布特罗 56341仑潘特 37158氧丙酚胺 579贝特罗 36894- 20 - 化合物 添加水平( g/ 猪肾 /% 猪肝 /% 牛肉 /% 猪肉 /% 异克仑潘特 N/A 喷特罗 54238乙醇胺 A N/A 上所述 ,24种 2 留 同时定性定量 检测方法的 灵敏度和精确度均能满足 于 食品安全风险监测和 应急检测的需要。 七、 标准 验证 情况说明 该方法经三个实验室的技术人员进行了方法验证试验 , 验证试验采用了添加法,分别对具有代表性的样品进行了 g/g/g/ 个不同水平的添加回收实验,每 个水平独立测定 6 次。 其结果见验证报告。 八、 验证结论 经验证该检测方法在精密度、准确度、检出限等方面完全达到了测定 动物源性食品 中 24 种 2 留 的检测要求,其方法方便、快捷,应推广应用。 九、 本 标准 作为强制性地方标准 的建议 通过以上一系列的实验研究, 本方法建立了样品经酶解、高氯酸沉淀蛋白, 净化和富集,选择 沙丁醇胺 - , 克伦特罗 , 莱克多巴胺 为内标,经P 18 柱超高效液相色谱柱分离,多通道 谱检测 24 种 - 21 - 2 留的 快速定量方法。具有前处理简单,选择性和灵敏度高,更具有实用性。 为严格控制非法使用 2 建议把 动物源性食品中 24 种 2受体阻断剂残留量的测定 液相色谱 作为强制的地方标准 批准发布 。 十、 贯彻标准要求和措施建议 1、 技术措施 要求熟练掌握前处理技术,了解仪器性能、原理,且能熟练操作,能对检测结果进行分析。 2、 管理措施 本技术标准在实施过程,严格执行 检验规范,熟悉检验方法和有关的法规,做到科学、公正、准确、不受其他因素干扰,确保检验结果的准确可靠。 3、 实施方案 标准由吉林省 卫生厅 发布,计划于 发布实施,由 政主管部门负责监督实施。 标准被批准后,组织力量,进行宣贯实施,通过该标准的贯彻实施,确保食品安全和保障人体健康等方面将产生 巨大 的经济效益和社会效益。 十一、 参考文献 2in 2000, 408: 285 - 22 - 2by 17: 891 3 苗虹 ,吴永宁 ,赵京玲 气相色谱 材料中的克伦特罗残留 5( 1) : 86 4 吴国华,邵兵,孟娟 质谱测定尿液中的克伦特罗 2004, 20 (2):235 5 苗虹 ,吴永宁 卫生研究, 2004, 33 ( 5) : 623 6 苗虹 ,王凌琰 ,吴永宁 分析化学, 2003, 31( 8) : 1024. 7 I, , V, et 1994, 6: 147 8 W, C, D. J . 2004, 813: 35 9 , , , et 2005, 529 : 199 10 R, I, L,et 996,68(11):1918. 11 WL K. J 2004, 87 : 31 12 贾晓飞,曲建强,孟娟,邵兵 . 超高效液相色谱 种 2卫生研究 , 2007, 36(4):489 - 23 - 晓飞,潘红峰等 . 超高效液相色谱 0种 2 中国卫生检验杂志, 2009,19( 11):246114. 002 657 6 23 EC of of 4 002, 6- 配套讲稿:
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