PMP柱前衍生高效液相色谱法
糖组成分析(PMP-HPLC混合单糖标准品的准备:称取各单糖标准品(L-Fuc;L-Rha;L-Ara;L-Xyl;D-Man;D-Gal;D-GIc;D-GalA;D-GIcA)溶于去离子水中,配成1mg/ml以待分析。多糖的水解称取2-4mg多糖样品于鸡心瓶(10ml)中,加入1mlH2O预溶,再加入1ml4M的TFA,橡皮膏封闭瓶口,置110C烘箱中水解(中性多糖水解2h,酸性多糖水解4h);冷却至室温后,加甲醇多次(4次)除去多余的TFA至无酸味;水解的多糖样品复溶于200卩LfO。单糖的PMP衍生化取50L多糖水解液或50讥混合单糖标准品溶液于2mlEP管中,分别与50L的0.6mol/L的NaOH溶液充分混合,加入100卩L0.5mol/L的PMP(0.2613g/3ml)甲醇溶液,塞紧塞子封紧后,漩涡振荡仪混匀;在70C水浴中反应100min,取出冷却至室温。加入100卩L0.3mol/L的HCI中和,再加700卩l去离子水以及1ml氯仿萃取,漩涡振荡,静置1-2h。吸取上层水相900卩I,再加入900卩l的氯仿萃取一次,静置1h,再去上层水相800卩l,再加入800卩l的氯仿萃取一次,或用低速离心代替静置处理。用带有0.22微孔滤膜的注射器过滤后,装入液相瓶中待HPLC进样分析。HPLC分析糖组成Agilent1260高效液相色谱系统色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-C18,250mrhC4.6mm,5ym;流动相:BufferA:15汇腈+85%磷酸盐缓冲液BufferB:40%乙腈+60%磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液:0.05M磷酸二氢钾缓冲液(pH6.7)KH2PO413.6g及NaOH1.8g溶液2L水中;乙腈(HPLC级);时间(min)BufferABufferB0100010901030802035802045802045.011000551000柱温:20C;紫外检测波长:254nm;流速:1ml/min;进样体积:20y。