聚合酶链反应技术体外扩增DNA

聚合酶链式反应（PCR）体外扩增DNA一 目的1 学习 PCR 反应的基本原理和实验技术。2 了解引物设计的一般要求。二 原理聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术。 利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片段，以用于基因工程操作。PCR进行的基本条件：（1）DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）（2）引物（3）dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）（4）Taq DNA聚合酶（5）反应缓冲体系PCR循环由三个步骤组成：（1）变性使模板DNA解离成单链；（2）退火 使引物与模板 DNA 所需扩增序列结合；（3）延伸DNA聚合酶利用dNTP合成与模板碱基序列互补的DNA链。 每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩 增可达 106倍。引物设计：要保证PCR反应能准确，特异，有效的对引物DNA进行扩增，通常引物 设计要遵循以下原则： 引物长度： 1525 个核苷酸； GC 含量为 40%60%； Tm 值为 55°C（Tm=4 （C+G） +2 （A+T）计算； 引物与非特异配对位点的配对率小于70%； 引物自身配对形成的茎环结构，茎的碱基对小于3， 两条引物间配对碱基数小于5个。 由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计。本实验以实验二中提取的质粒DNA为模板，进行PCR扩增，大量得到目的DNA片段。三 试剂与仪器（一）试剂1. Taq DNA 聚合酶（5U/“）l2. 10x反应缓冲液（含25mmol MgCl2）3. dNTP4. 引物（P1、P2）5. 溴乙啶（EB）： 10mg/ml溴乙啶。注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。6. 点样缓冲液 Loading buffer（10x）： 0.25%溴酚蓝， 40%甘油。（二）仪器1. PCR扩增仪2.电泳仪3.台式离心机4.紫外分析仪5.恒温水浴6.凝胶成像系统四 操作步骤（一） PCR扩增1 按下表加入试剂，并小心混匀。模板为实验一中提取的质粒DNA。试剂体积（20卩1）模板0.5卩110 x buffer2卩1lOxdNTP2卩1Primer P11卩1Primer P21卩1ddH2O补足到20卩1Taq酶2U2.设置PCR程序:94 °C180s94 C45s30 cycles: J 55 C45s-72 C60s72C600s3 .运行PCR程序（二） PCR产物鉴定反应结束后，取20卩1 PCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。