聚合酶链反应技术体外扩增DNA
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1、聚合酶链式反应(PCR)体外扩增DNA一 目的1 学习 PCR 反应的基本原理和实验技术。2 了解引物设计的一般要求。二 原理聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)是体外酶促合成DNA片段的一种技术。 利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片段,以用于基因工程操作。PCR进行的基本条件:(1)DNA模板(在RT-PCR中模板是RNA)(2)引物(3)dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)(4)Taq DNA聚合酶(5)反应缓冲体系PCR循环由三个步骤组成:(1)变性使模板DNA解离成单链;(2)退火 使引物与模板 DNA 所需扩增
2、序列结合;(3)延伸DNA聚合酶利用dNTP合成与模板碱基序列互补的DNA链。 每一个循环的产物可作为下一个循环的模板,通过30个左右循环后,目的片段的扩 增可达 106倍。引物设计:要保证PCR反应能准确,特异,有效的对引物DNA进行扩增,通常引物 设计要遵循以下原则: 引物长度: 1525 个核苷酸; GC 含量为 40%60%; Tm 值为 55C(Tm=4 (C+G) +2 (A+T)计算; 引物与非特异配对位点的配对率小于70%; 引物自身配对形成的茎环结构,茎的碱基对小于3, 两条引物间配对碱基数小于5个。 由于影响引物的设计的因素比较多,所以常常利用计算机来辅助设计。本实验以实验
3、二中提取的质粒DNA为模板,进行PCR扩增,大量得到目的DNA片段。三 试剂与仪器(一)试剂1. Taq DNA 聚合酶(5U/“)l2. 10x反应缓冲液(含25mmol MgCl2)3. dNTP4. 引物(P1、P2)5. 溴乙啶(EB): 10mg/ml溴乙啶。注意:该试剂具致癌作用,用时要小心。6. 点样缓冲液 Loading buffer(10x): 0.25%溴酚蓝, 40%甘油。(二)仪器1. PCR扩增仪2.电泳仪3.台式离心机4.紫外分析仪5.恒温水浴6.凝胶成像系统四 操作步骤(一) PCR扩增1 按下表加入试剂,并小心混匀。模板为实验一中提取的质粒DNA。试剂体积(20卩1)模板0.5卩110 x buffer2卩1lOxdNTP2卩1Primer P11卩1Primer P21卩1ddH2O补足到20卩1Taq酶2U2.设置PCR程序:94 C180s94 C45s30 cycles: J 55 C45s-72 C60s72C600s3 .运行PCR程序(二) PCR产物鉴定反应结束后,取20卩1 PCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。
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