I型胶原-壳聚糖复合材料生物相容性研究

.I型胶原-壳聚糖复合材料的生物相容性研究基金项目：国家自然基金项目(30973048)；科技部国际合作重点项目（2008GR0403）；国家人力资源与社会保障部2009年度留学回国人员科技活动择优资助项目作者简介：张永强（1985-），男，在读硕士研究生，研究方向为关节软骨的损伤与修复*通讯作者：杨自权（1972-），男，副主任医师，硕士研究生导师，e-mail:yzqonline卫小春（1951-），男，主任医师，博士研究生导师，硕士研究生导师,e-mail:weixiaochun06张永强1任志鹏1杨自权1*孙晓丹2卫小春1*1山西医科大学第二医院骨科骨与软组织损伤修复山西省重点实验室0300012清华大学材料工程学院【摘要】目的评价I型胶原-壳聚糖复合材料作为组织工程支架材料的生物相容性。方法体外培养兔骨髓间充质干细胞（BMSCs），采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测不同分组的BMSCs生长情况，酶标仪测吸光度值（OD），计算细胞相对增值率（RGR）；利用材料浸提液与兔新鲜血混合观察红细胞溶解情况，评价材料细胞生物相容性。结果空白组（A组），50浓度组（B组）和100浓度组（C组）BMSCs均生长良好，并于1、3、5天逐渐增殖，阳性对照组（D组）细胞于第天开始变圆、皱缩，3天和5天均皱缩死亡。A、B、C三组细胞在第1、3、5天各组吸光度值无显著差异（P>0.05），但均与组有明显统计学差异（P<0.05）。材料相对溶血率为4.1。结论I型胶原-壳聚糖复合材料无明显细胞毒性，有良好的生物相容性。【关键词】胶原-壳聚糖材料；细胞毒性试验；溶血试验BiocompatibilityresearchesoftypeIcollagen-chitosanscaffoldZhangyongqiang1,Renzhipeng1,Yangziquan1*etal.1DepartmentofOrthopedics,thesecondhospitalofShanxiMedicalUniversity,boneandsofttissuehealingKeyLaboratoryofShanxiProvince;2TsinghuaUniversity,InstituteofMaterialsEngineeringAbstractObjectiveToevaluatethebiocompatibilityofthetypeIcollagen-chitosanscaffoldfortissueengineering.MethodsCulturedbonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs)in4differentgroups(A,B,CandD).Usedtetrazoliumsalt(MTT)colorimetrictoassaythegrowthofdifferentgroups,andmeasuretheopticaldensity(OD)bymicroplatereader,thencalculatetherelativegrowthrate(RGR%).Mixedthescaffordextractswithfreshbloodoftherabbit,thegradeofhemolysiswasmadeinthemeasuresofopticaldensityat492nm.ResultsBMSCsofgroupA,groupBandgroupCweregrowingwell,andproliferatinggraduallyinthe1st,3rdand5thday.Thepositivecontrolgroup(D)cellsroundedandwrinkledinthe1stday,then,cellswereshrinkagedeath.TheopticaldensitywerenosignificantstatisticaldifferencesbetweengroupA,BandC(P>0.05),butallhadsignificantstatisticaldifferenceswithgroupD(P<0.05).Hemolysispercentageofthescaffordwas4.1%.ConclusionIcollagen-chitosanscaffordhasnosignificantcytotoxicity,andaccordswiththebiomaterialstandardsoftissueengineering.KeywordsIcollagen-chitosanscafford;Testofhemolysis；Testforcytotoxicity壳聚糖是一种天然高分子生物材料，为线性多糖，是氨基多糖(GAG)的异构物。在自然界中广泛存在,是一种来源广泛、容易获得并具有良好生物相容性的可降解生物材料。I型胶原是很多组织的细胞外基质成分，并已应用于很多组织工程的支架材料中，但由于单独应用具有降解速率快、物理性能差等不足，因此常常与其他材料复合，以避免一些不足。本实验研究的I型胶原-壳聚糖复合材料是一种将I型胶原和壳聚糖有机结合的新型组织工程复合载体支架材料。细胞毒性实验是一类在离体状态下模拟生物体生长环境，检测材料和器械接触机体组织后生物学反应的体外试验，它是对材料进行生物学评价的重要检测指标之一。本实验通过四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测材料浸提液对骨髓间充质干细胞（BMSCs）生长的影响，同时进行材料浸提液的溶血试验检测，评价新型载体材料I型胶原-壳聚糖复合材料作为组织工程支架材料的生物相容性。材料与方法1主要试验材料、试剂和仪器I型胶原-壳聚糖复合材料（清华大学提供）；2月龄新西兰大白兔（山西畜牧研究所）；胰酶（Sigma公司）；DMEM-F12（赛默飞世尔生物化学有限公司）；胎牛血清（杭州四季青）；四甲基偶氮唑盐（Sigma公司）；苯酚（天津市福晨化学试剂厂）；BB5060型CO2培养箱（Heraeus公司）；MK3型酶标仪（热电上海仪器有限公司）。2细胞毒性试验2.1BMSCs的培养取2月龄新西兰大白兔，称重为3kg。耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（1ml/kg体重）约3ml麻妥，无菌条件下于双侧股骨大转子处穿刺，分别自两侧骨髓腔中抽取骨髓至含有2ml肝素（3000U/ml）注射器内，置于离心管中冲洗离心后，各加含10%胎牛血清DMEM-F12培养基5ml，分装于2个25cm2培养瓶内，置入37，5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。3d后首次换液，以后每2-3d换液一次。待细胞长满瓶底达80-90%（图），进行传代，传至三代（图2）备用。2.2 浸提液的制备1（ISO10993-5）根据GB/T16886.522003/ISO10993-5:1999医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验中的浸提液试验，将材料按1cm²试样表面积加10ml浸提介质比例在37恒温箱中浸提24h。浸提介质为含10%小牛血清的DMEM-F12培养液。2.3实验分组及检测空白组(A组)：含10%小牛血清的DMEM-F12培养液50%浓度组（B组）：材料浸提液浓度为50%100%浓度组（C组）：材料浸提液浓度为100%阳性对照组（D组）：0.64%苯酚取第三代BMSCs，配制成1×105/ml细胞悬液，取3块96孔培养板，每板4组，每组10孔，每孔加100ul细胞悬液，置于条件同前的培养箱中培养。24小时后，弃去原培养液，用PBS液洗涤2次后，分别按实验分组进行换液，再把培养板放入原培养箱内继续培养，分别于1、3、5天各取出一块培养板，在倒置相差显微镜下观察活细胞形态、摄影，然后加入20ul孔MTT液，继续培养6小时，吸除原液，再加入150ul孔二甲基亚砜（DMSO），震荡10分钟，在酶联免疫检测仪上以450nm波长测吸收值。按下式计算细胞相对增殖率(RGR)：RGR=（实验组吸光值/空白对照组吸光值）×100%对所得RGR按美国药典细胞毒性分级标准对其进行毒性分级。美国药典2（USPXXII24版）中细胞相对增殖率与细胞毒性的分级的关系(下表)TherelationshipbetweencellproliferationrateandcytotoxicitygradeofUSP细胞相对增殖率()细胞毒性分级1000801502303043溶血试验3.1采集新西兰大白兔血4mL与2mL肝素（3000U/ml）混合备用。3.2实验分组及检测试验分组：生理盐水组(阴性对照)、实验组（材料100%浸提液）和蒸馏水组(阳性对照组)。每组10个样本，每个样本5mL。取抗凝新鲜血液0.1mL分别加入3组样品中，37培养箱孵育60min。观察大体样本溶血情况。低速离心机3000rmin10min，酶标仪492nm下对样品进行OD值检测。溶血率=(Dt-Dnc)(Dpc-Dnc)×100按上述公式计算溶血率(Dt：待测OD值；Dpc：阳性对照OD值；Dnc：阴性对照OD值)。4统计分析对MTT法及溶血试验测得各组吸光度值采用均数标准差表示，并行单因素方差分析，用SPSS17.0统计软件进行分析。结果1细胞毒性试验1.11天后倒置显微镜下观察A、B、C三组BMSCs生长状态均良好，细胞多呈梭形或多角形（图3）。D组细胞无明显生长，基本开始变圆，皱缩（图6）。表1：细胞相对增殖度和细胞毒性等级（1天）组别OD值(SD，n=10)细胞相对增殖度RGR(%)细胞毒性等级A空白对照组0.31880.0226100.00B50%浸提液组0.30250.033194.90C100%浸提液组0.29960.013394.00D阳性对照组0.07540.009923.74“”示：与A组比较P<0.05。1.2第3天可见前三组细胞数明显较前增多，细胞逐渐聚集融合。三组细胞生长状况均良好，无明显差异（图4）。D组细胞皱缩死亡。（图6）。表2：细胞相对增殖度和细胞毒性等级（3天）组别OD值(SD，n=10)细胞相对增殖度RGR(%)细胞毒性等级A空白对照组0.43700.0532100.00B50%浸提液组0.44920.0506102.70C100%浸提液组0.45800.0793104.80D阳性对照组0.07490.003617.14“”示：与A组比较P<0.05。1.3第5天镜下见A、B、C三组BMSCs数量较前明显增多，且呈梭形，三角形（图5）。D组细胞成片死亡（图6）。表3：细胞相对增殖度和细胞毒性等级（5天）组别OD值(SD，n=10)细胞相对增殖度RGR(%)细胞毒性等级A空白对照组0.69070.1105100.00B50%浸提液组0.65630.090995.00C100%浸提液组0.62560.149890.60D阳性对照组0.07190.001410.44“”示：与A组比较P<0.05。第1、3、5天A、B、C三组OD值均无明显差异（P>0.05）（如表4），细胞毒性等级均为0级。2溶血试验2.1样本大体观察生理盐水组和实验组静置后各管内均可见血细胞沉积，而蒸馏水组各管颜色均一，呈淡红色，无明显血细胞沉积。2.2溶血率表5：吸光度值和溶血率(SD，n=10)生理盐水组蒸馏水组实验组OD值0.05110.01470.45360.02820.06780.0100溶血率0%100%4.1%生理盐水组与实验组OD值无明显差异（P>0.05）,与蒸馏水组有差异（P<0.05）。计算得材料相对溶血率为4.1%。讨论在组织工程研究中，作为组织和细胞生长的载体，支架材料的选择至关重要3（IsmarulIN,2004）。I型胶原-壳聚糖复合材料结合了胶原和壳聚糖材料的优点，是一种新型的组织工程支架材料。本实验通过四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测材料浸提液对骨髓间充质干细胞（BMSCs）生长活性的影响，同时进行材料浸提液的血液相容性检测，进而评价I型胶原-壳聚糖复合材料的生物毒性。MTT法最早是由Mosroanm于1983年提出4（MosroanmT，1983），现已广泛应用于对材料的细胞相容性的评价5,6（CiapettiG,1993;WatahaJC,1994）。其原理是线粒体琥珀酸脱氢酶能使四甲基偶氮唑盐还原成蓝色甲替，形成的多少与活细胞数量和功能状态成正相关。因此可以从吸光度值（OD值）间接反映细胞数量和活力。在本实验中，空白组、50%浓度组和100%浓度组的细胞随着培养时间的延长，三组OD值均逐渐增加，即细胞数量增加，表明50%和100%的I型胶原-壳聚糖复合材料浸提液对BMSCs的增殖无明显影响。而阳性对照组随着时间的延长，OD值逐渐减小，细胞数目减少，细胞死亡，表明0.64%的苯酚严重影响了BMSCs的生长和增殖，并有细胞致死性。第1、3、5天，空白组、50%浓度组和100%浓度组三组之间OD值无明显差异（P>0.05），但均与阳性对照组有显著差异（均P<0.05）。将50%和100%I型胶原-壳聚糖复合材料浸提液对BMSCs的毒性检测结果按美国药典中细胞相对增殖率与细胞毒性的分级关系进行分级，其细胞毒性均为0级。故I型胶原-壳聚糖复合材料符合组织工程支架材料的无毒性要求。溶血试验被认为是细胞毒性评价的一个补充实验。其原理为血浆中血红蛋白量升高指示溶血并反映出在与材料接触中红细胞膜的易破裂性。本实验中生理盐水组和实验组静置后各管内均见到有血细胞的沉积，两组OD值无明显差异（P>0.05）。而蒸馏水组各管颜色均一，呈淡红色，表现为明显溶血的现象，其OD值与生理盐水组和实验组均有显著差异（均P<0.05）。最终求得材料浸提液相对溶血率为4.1%，符合溶血率<5%的标准要求7（ISO10993-4）。进一步补充说明了I型胶原-壳聚糖复合材料的无毒性。理想的骨组织工程支架材料除了对机体无毒性以外，还应具有良好的表面相容性，一定的生物活性，可降解性和良好的结构相容性等8（HunzikerE,1999）。所以对于I型胶原-壳聚糖复合材料还需从这些方面进一步研究。图3第1天：A，B，C三组细胞均生长良好，细胞呈梭形或三角形（×100）图图2原代BMSCs细胞（×100）三代BMSCs细胞（×100）附图：图4第3天：，三组数量较前增多，生长良好（×100）图5第5天：，三组各孔趋于融合，细胞生长良好。图6，分别表示第，天组变圆，固缩，死亡。参考文献1ISO10993-5：1999BiologicalevaluationofmedicaldevicesPart5：Testsforinvitrocytotoxicity2USPXXII24BilolgicalTests/BiologicalReactivityTests，Invivo3IsmarulIN,IshakY,IsmailZ,eta1CharacterizationofcollagenchitosanfilmsforskinregeneratingscaffoldMedJMalaysia2004；SupplB：57-58.4Rapidcolorimetricassayforcellulargrowthandsurvival:applicationtoproliferationandcytotoxicityassaysJ.ImmunMeth,1983,65(1-2):55-63.5CiapettiG,GenniE,PratelliL,etal;Invitroevaluationofcell/biomaterialinteractionbyMTTassayM;Biomaterials,1993,14(5):359-364.6WatahaJC,HanksCT,CraigRG.Invitroeffectsofmetalionsoncellularmetabolismandthecorrelationbetweentheseeffectsandtheuptakeoftheions,J.Biomed.Mater.Res.1994,(28):427-433.7ISO10993-4：2002Biologicalevaluationofmedicaldevices-Par4：Selectionoftestsforinteractionswithblood8HunzikerE.Biologicalrepairofarticularcartilage:defectmodelsinexperimentalanimalsandmatrixrequirements.ClinOrthop1999;367(S):135-146.17